CN115772533B 一种细菌连续进化系统、正交易错dna聚合酶及连续进化方法 （江南大学）

US2019153472A1,2019.05.23US6228628B1,2001.0一种细菌连续进化系统、正交易错DNA聚合复制系统与正交易错DNA聚合酶结合后，获得了一种能够包含所有突变类型、可实现长DNA片段过诱导DNA聚合酶表达的开启与关闭，实现线性2所述线性质粒上包括DNA复制与控制基因簇、启动子和目的基因，所述DNA所述DNA聚合酶突变体由氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的DNA聚合酶突变得到；所述3.根据权利要求1所述的细菌连续进化系统5.一种正交易错的DNA聚合酶突变体，其特征在于3利要求8所述的细胞在苏云金芽孢杆菌连续进化或易错复制中的应4[0002]定向进化技术通过文库构建与高通量筛选过程实现新的基因表达元件或高效酶发了多种连续进化方法以克服这一困难。连续进化的关键在于可以实现体内目的DNA序列续进化方法，是将正交DNA复制系统与正交易错DNA聚合酶结合后获得的能够满足4个关键控制基因簇的核苷酸序列如SEQID[0006]所述DNA聚合酶突变体由氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的DNA聚合酶突变得到；[0007]将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸5酰胺突变为甲硫氨酸(D18A/D70A/L403[0014]MSTTNRKKRREIKLFTLDTETRGLDGDVFRIGLFDGKQYYTGYTFADVLPVFEKYKAYDCHVYIHNLDFDLSKIIAELRDYAEPTFNNSLFINGNIVTFTASHIILHDSFRLLPSSLENLCRDFDLLEGGKMDIVDYMEENNYGIYNVKNRKLNKRLTKGNFFTTVDKDDPVLCEYMEYDCRSLYKILEIVIGLSKLEVEQFINCPTTASLAKTVYKEQYKKDYKVAISTKQYNHKQLGKGLEAFIRKGYYGGRTEVFTPRIENGYHYDKNSLYPYVMKMAEMPVGYPNVLDNEEAELSFDLWKRRRYGAGFIHAKVHVPEDMYIPILPKKDYTGKLIFPVGKIEGVWTFPELALAEAEGCKIEKIESGVVFEKTAPVFREFISYFEEIKNTSKGAKRAFSKLMQNALYGKFAMQRERIMYADISERDKLEAEGHTVSEIIYDMNGIRMEFLEYDGYAMAEYIQPHISAYITSIARILLFKGLKYAHEKGILAYCDTDSCATTTKFPDKMVHDKEYGKWKLEGYVIEGLYFQPKMYAEKAINTDGEYEEVLRMKGVPKWVVEEQLDYNSFRKWYLQVKRGKAEIPIYKGGERVQKFLTKSKNNIEMNELAEMHKTINFAREQKRNIDLNKNITSPLVRNDYGENKDEKSEYEFDEWYERLEEFNDDMNAVEELCMKFGKIQIPEKKQRKLYGLYKEYSSKAKAMCFSNEGLPIQDWCKKTGWDMKELLGEL粒载体突变率的测定提供了一种方法。在本发明的一个实施例中，选用的是由终止密码子[0019]attatgtacctctactagcctattaaaatatttacctattgacacgtaataacatttatgaaatatga[0021]Tatatcgtgaaacatagatgtttatttgtgtcaatgggtaatattggtaaaagtgctagtagggatac[0025]进一步地，所述线性质粒载体由GIL16正交DNA聚合酶(野生型聚合酶的氨基酸序6[0031]进一步地，所述细菌为苏云金芽孢杆菌，包括但不限于苏云金芽孢杆菌HD_1[0033]将第18位的天冬氨酸突变为丙氨酸，同时将第70位的天冬氨酸突变为丙氨酸[0042]本发明的第五个目的是提供一种携带上述编码上述正交易错的DNA聚合酶突变体[0043]本发明的第六个目的是提供一种表达上述正交易错的DNA聚合酶突变体的细胞。[0046]本发明的第八个目的是提供一种基于细菌正交易错DNA聚合酶的连续进化方法，内通过正交易错复制线性质粒以实现目的蛋白(由目的基因编码)随机突变文库构建与高7[0050]本发明通过构建基于细菌正交线性基因表达载体的连续进化方法，实现了靶DNA[0051]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚8[0068]首先构建了辅助质粒pBMB_ESC(序列为SEQID高效重组。具体来说，在此质粒上通过使用木糖诱导表达Exo(双链DNA5'_3'外切酶)、EcoSSB(大肠杆菌来源单链DNA结合蛋白)和CspRecT(DNA退火蛋白)以实现DNA片段在胞内[0069]线性质粒整合框的构建采用融合PCR的方式。首先设计同源臂长度为500_1000bpggacctctttagctccttgg扩增红霉素抗生素抗性蛋白表达框并引入TAA终止密码子，使用引caattacggcttgtgcttcctctcg扩增右霉素条件下生长，而含有由TAA终止密码子提前终止的红霉素抗性基因的菌株再添加氯霉9[0083]基因组突变率的测定方法与正交DNA聚合酶突变率测定方法相同，但不需添加木获得利福平抗性：V135F(gtt_ttt),Q137R(cag_cgg),Q4Q468L(cag_ctg),