备课素材：基因编辑技术课件高二下学期生物人教版选择性必修3

基因编辑技术1.CRISPR/Cas9系统2.Cre/loxP系统【思维·探究】【情境】CRISPR-CasⅥ型Cas13系统原核生物通常具有多种抵抗入侵的策略,以便在频繁的病毒攻击或侵入的遗传元件中生存。其中,CRISPR-Cas监测系统已进化得十分丰富,并得到了广泛的研究。其中备受关注的CRISPR-CasⅥ型Cas13系统便成为研究的热点,该系统通过靶ssRNA进入crRNA-Cas13a复合物内与crRNA发生碱基互补配对,诱发Cas13a发生构象变化,从而激活crRNA-Cas13a复合物的酶切活性,可以降解外源RNA,从而提供适应性免疫。值得注意的是,与DNA引导的Cas9和Cas12系统不同,Cas13具有RNA激活的RNase活性。【探究】(1)CRISPR-CasⅥ型Cas13系统在体内外细胞的RNA裂解过程中显示出特异性的原因是_____________________________________________________________________________________。

【解析】(1)靶ssRNA进入crRNA-Cas13a复合物内与crRNA发生碱基互补配对,诱发Cas13a发生构象变化,从而激活crRNA-Cas13a复合物的酶切活性,可以降解外源RNA。靶ssRNA进入crRNA-Cas13a复合物内与crRNA通过碱基互补配对而特异性识别和结合(2)与CRISPR/Cas9能特异性识别和切割DNA相比,CRISPR-CasⅥ型Cas13系统在研究基因表达方面的优势是__________________________________。

【解析】(2)与DNA引导的Cas9和Cas12系统不同,Cas13具有RNA激活的RNase活性,可以降解外源RNA。可在RNA水平上研究基因表达。可在RNA水平上研究基因表达【思维·源点】1.同源重组法进行基因敲除基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强并互补结合时,结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能,原理如下图所示:2.CRISPR/Cas9基因组编辑系统(1)系统简介:①当细菌受到噬菌体的侵染时,它的某段DNA序列被内切核酸酶剪切后释放到细菌细胞质中,细菌将其作为新的“间隔序列”整合到CRISPR的间隔序列区域,从而使细菌“记住”这种外源基因。②当再次遇到该外源基因时,则在随后转录出相应的crRNA,crRNA可以引导Cas9内切核酸酶找到并切断噬菌体释放的噬菌体DNA,从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖,以达到保护自身的目的。(2)系统应用:①定点编辑基因:可以设计一个表达载体,载体在细胞内要完成两件事:一是转录出一段与待编辑的目标DNA片段的特定区域互补的向导RNA(sgRNA),这里的sgRNA相当于细菌体内的crRNA;二是表达出Cas9内切核酸酶,它在sgRNA的引导下,找到要编辑的目标DNA序列并将其切断。之后,细胞内天然的DNA修复过程被激活,就可以实现对基因组的精确编辑。②敲除基因:可以设计两个表达载体,在细胞中分别表达出能与待敲除基因两端相结合的sgRNA1、sgRNA2与Cas9内切核酸酶,Cas9内切核酸酶会在sgRNA1和sgRNA2的带领下完成两次切割,实现对目的基因的敲除。(3)脱靶问题:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对基因组编辑时,可能出现非特异性切割,称为“脱靶”,为了避免这种现象,可以适当增加sgRNA的长度,设计出特异性较强的sgRNA。

【迁移·应用】

重组DNA分子碱基互补配对

2.(不定项)研究人员利用基因编辑技术(CRISPR-Cas9)对小鼠的β-珠蛋白基因进行定点敲除,构建地中海贫血模型,并尝试通过干细胞移植进行治疗。下列叙述错误的是(

)A.CRISPR-Cas9系统中,向导RNA的碱基序列与靶基因的互补配对决定了Cas9蛋白的切割位点B.若敲除β-珠蛋白基因时意外破坏了相邻的δ-珠蛋白基因,可能导致基因编辑脱靶,该变异属于染色体结构变异C.移植的造血干细胞需与受体小鼠的MHC蛋白匹配,否则会引发免疫排斥反应D.为检测基因编辑效果,可提取小鼠骨髓细胞的DNA进行PCR扩增,并通过电泳比较产物片段大小与野生型小鼠的差异√【解析】选B。向导RNA通过碱基互补配对引导Cas9蛋白定位到靶基因特定位置进行切割,这是CRISPR技术的核心原理,A正确;相邻基因被破坏属于基因突变,而非染色体结构变异,B错误;MHC匹配是避免免疫排斥的关键,C正确;通过PCR扩增靶基因区域并电泳比较,可验证基因是否被成功敲除(野生型与突变型产物长度可能不同),D正确。3.某科研团队拟利用CRISPR/Cas9技术对病毒复制酶基因进行定向编辑并导入怀地黄细胞中,结合植物组织培养技术,培育出脱毒且抗病毒的怀地黄新品种。下列叙述正确的是(

)A.用茎尖进行植物组织培养获得脱毒苗是因为病毒无法进入茎尖细胞B.CRISPR/Cas9基因编辑技术可以使病毒复制酶基因发生随机突变C.进行植物组织培养时需要在培养基中添加干扰素以防止细菌的污染D.需要对培育出的再生植株进行病毒接种实验以验证其抗病毒能力√【解析】选D。植物顶端分生区附近(如茎尖)的病毒极少,甚至无病毒,故用茎尖进行植物组织培养可获得脱毒苗,A错误;依题意,CRISPR/Cas9技术是对基因进行定向编辑(如敲除或替换),而非引发随机突变,B错误;干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白,对细菌无效,植物组织培养中防止细菌污染需添加抗生素(如青霉素),C错误;要验证培育出的再生植株具有抗病毒能力,需要对其进行病毒接种实验,观察植株的表现,D正确。4.经典的CRISPR-Cas9系统可以通过敲除基因实现基因沉默。近日研究人员基于CRISPR系统开发了一个名为CRISPRoff的新型编辑器,可以将甲基(Me)添加在DNA链的特定位点上;研究人员还创建了功能相反的编辑器——CRISPRon,它能逆转基因沉默。下列叙述正确的是(

)A.新型编辑器对染色体DNA的效果低于染色质DNAB.CRISPRoff利用基因重组来实现基因沉默C.CRISPRoff对基因的影响不能遗传给后代D.CRISPRon有助于基因与DNA聚合酶结合以恢复表达√【解析】选A。新型编辑器可将甲基添加在DNA链的特定位点上,由于染色体螺旋化程度高,故新型编辑器对染色体DNA的效果低于染色质DNA,A正确;CRISPRoff将甲基(Me)添加在DNA链的特定位点上,是表观遗传的一种,属于可遗传变异,能够遗传给后代,没有引起碱基序列改变,也没有引起基因重组,B、C错误;基因沉默是相关基因无法表达,CRISPRon能逆转基因沉默,即有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达,D错误。Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能在DNA特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，是一种广泛应用的基因编辑工具，可以达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，在真核和原核系统中均适用。Cre-LoxP重组酶系统基因编辑1.Cre-LoxP重组酶系统的组成Cre-LoxP系统是一种基于位点特异性重组的基因编辑技术，由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成‌。Cre是一种重组酶，1981年从P1噬菌体（一种温和的细菌寄生体）中发现。Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即Loxp位点，介导Loxp位点间的基因序列删除或重组。LoxP来源于噬菌体P1，是一段长度为34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个不对称的8bp间隔区共同组成。反向重复序列是Cre重组酶的特异识别和结合区域，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。2.Cre-LoxP重组酶系统基本作用机理（以基因敲除‌为例）Cre重组酶是一种DNA重组酶，由噬菌体P1的环化重组酶基因编码。它能够识别LoxP位点的特定DNA序列。Cre-LoxP系统主要用于基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。下面重点讲一讲基因敲除的作用机理。（1）基因敲除‌：通过Cre重组酶删除两个LoxP位点之间的序列。基因敲除的原理就是利用Cre-LoxP系统对目的基因进行特异性重组。具体来说，研究人员会在目的基因的两端分别插入两个LoxP位点。当携带Cre重组酶的载体转染进入细胞或动物模型后，Cre重组酶就会在两个LoxP位点之间切割DNA，导致目的基因被删除或重排，从而实现基因敲除。以上述图1为例，首先是构建含有LoxP位点的基因序列，在体外构建一个基因序列，该序列在目的基因的两端分别含有一个LoxP位点。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向loxP序列时，Cre酶识别并结合到loxP序列的反向重复序列区。两个loxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是磷酸二酯键，敲除的基因片段会形成环状结构。‌‌（2）基因翻转‌：当两个LoxP位点方向相反时，Cre重组酶系统能诱导序列翻转。（3）基因易位‌：当两个LoxP位点分别位于不同的DNA链或染色体上时，Cre重组酶系统诱导DNA链的交换或染色体易位，即基因转座。‌（4）序列互换‌：当四个LoxP位点分别位于不同的DNA链或染色体上时，Cre重组酶系统诱导序列互换‌。3.Cre-LoxP重组酶系统的优缺点Cre-LoxP系统是目前在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，主要是因为该系统有如下优点：高效性：Cre重组酶与具有LoxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效。特异性强：LoxP位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的34bp元件，这种结构保证了LoxP序列的唯一性，从而保证基因重组的特异性很强。应用范围广：Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用。Ⅱ型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种Ⅱ型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的胜利条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。Ⅱ型启动子可分为组成型启动子、特异性启动子、诱导启动子，其特点是转录产物长度不限，编码与否不限等特点。但也有缺点，一是操作复杂‌，需要精确控制Cre重组酶的表达时间和空间，操作较为复杂；二是对细胞毒有性‌，长期表达Cre重组酶可能对细胞有毒性影响。1．Cre重组酶可以切除两个loxP序列之间的基因并使其失活。科学家将一个Cre重组酶基因(C)导入到黑体雌果蝇的常染色体上，将该雌果蝇与一只X染色体上定点插入了显性灰体基因A(基因A两侧含有loxP序列)的转基因灰体雄果蝇杂交，得到F1,F1随机交配得到F2。下列分析不正确的是（

）A．F1和F2中含有C基因的果蝇均为黑体色

B．C基因和A基因的遗传遵循孟德尔遗传规律C．F1中灰体雌性果蝇占1/4

D．F2中灰体雄性果蝇占3/16D【迁移·应用】2．Cre酶是一种重组酶，LoxP是能被Cre酶识别的特异DNA序列。Cre/LoxP重组酶系统能够实现特异位点的基因敲除、基因插入等操作。一般而言，当一条DNA链上存在两个相同的LoxP序列且方向相同时，Cre酶能有效切除两个位点间的DNA序列，如图所示。下列说法正确的是（）A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开B．无Cre酶存在的细胞因STOP的作用而无法发出荧光C．当有两个相同的LoxP序列时Cre酶就能有效切除一个D．启动子能启动绿色荧光基因翻译荧光蛋白的过程B3.(不定项)(2025·海口模拟)Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起,构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”,且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因,最多会被Cre酶敲除一次,剩下的部分得以表达,随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是(

)A.构建表达载体T时用到的工具包括限制酶、DNA连接酶B.若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶),其肌肉组织细胞呈无色C.若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶),其脑组织细胞只能呈红色或黄色D.若小鼠细胞含2个表达载体T(含Cre酶),其脑组织细胞可能出现两种颜色√√√【解析】选A、B、D。基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理,A正确;据图可知,小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因,前端有脑组织特异性表达的启动子,肌肉细胞不会表达颜色基因,故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶),其肌肉组织细胞呈无色,B正确;1oxP1、1oxP2位置如图2黑白三角符号所示,两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次,Cre酶表达情况不同,识别的loxP不同,则有可能未敲除荧光蛋白基因,此时为红色(同不含Cre酶时),也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因,此时为黄色,也有可能敲除两个loxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因,此时为蓝色,因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因,C错误;小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶),Cre酶对每个DNA片段随机剪切,因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成,故其脑组织细胞可能出现两种颜色,D正确。4.我国科学家利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植(SCNT)技术,成功构建了世界首例体细胞BMAL1基因(产生昼夜节律必需的基因)敲除的生物节律紊乱猕猴,为相关疾病研究提供了新型动物模型,其基本构建流程如图所示。CRISPR/Cas9基因编辑系统能在DNA特定位置进行切割,被切割的DNA修复时会发生基因突变而导致靶基因失活,第一代BMAL1基因敲除猕猴的5只个体表现出不同程度的节律紊乱症状。为进一步获得理想动物模型,研究团队采集A6个体的成纤维细胞,经SCNT后最终获得多只第二代BMAL1基因敲除猕猴模型。请回答下列相关问题:(1)在猕猴各级神经中枢中,与生物节律控制有关的中枢在___________。

【解析】(1)在猕猴各级神经中枢中,与生物节律控制有关的中枢在下丘脑。下丘脑(2)经CRISPR/Cas9基因编辑和胚胎移植获得的第一代BMAL1基因敲除猕猴的不同个体表现出不同程度的节律紊乱症状,原因是___________________________________________________________________________________________________。

CRISPR/Cas9对不同个体的DNA特定位置进行切割,被切割的DNA修复时最终导致不同位点的基因突变【解析】(2)CRISPR/Cas9对不同个体的DNA特定位置进行切割,被切割的DNA修复时最终导致不同位点的基因突变,所以不同个体表现出不同程度的节律紊乱症状。(3)实验中采集的卵母细胞通常在体外培养至________期,进行动物成纤维细胞体外培养时置于含有__________