高三生物二轮复习课件基因工程题型拓展（PCR专题）

Itcouldbethepartofthepresentationwhereyoucanintroduceyourcompanyoragency.基因工程题型拓展——PCR微专题目录TABLEOFCONTENTS01PCR的数量关系02引物的选择和设计03PCR的应用PCR的数量关系01PCR的数量关系思考1：图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。PCR的数量关系思考2：完成下表PCR中的数量关系小结复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1目标DNA分子数非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1234567246810121400282252114非目标DNA数目目标DNA数目循环次数1202403624885102261252714114n2n2n-2nPCR的数量关系思考2：完成下表PCR中的数量关系小结复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1目标DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n引物的选择和设计02引物的选择和设计引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的原则主要包括：(2)引物G+C含量以40%-60%为宜，4种碱基最好随机分布。G+C太少：与模板DNA链结合的氢键少，结合力小，扩增效果不佳；G+C过多：可导致引物自身之间形成二聚体或多聚体，会降低扩增效率，同时需要更高的退火温度，进而增加实验成本。。(1)引物长度应大于16个核苷酸(通常为20～30个核苷酸)，可防止随机结合，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。思考与讨论：复性时，为何两条模板链能与引物结合而不是模板链之间结合呢？这是因为，引物一般只有20~30个核苷酸，复性温度就是根据引物序列专门设定的，而且引物的浓度远大于模板的浓度，所以当温度下降到复性温度时，引物会更快地特异性结合在模板上。

引物的选择和设计

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的原则主要包括：(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。在3′端不应有任何互补的碱基。(4)引物的5′端可以修饰(添加酶切位点、引入突变序列)，但3′端不可修饰(与模板DNA配对)。引物的选择和设计例1：土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为（

）A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′A引物的选择和设计例2：（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题∶设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的2组引物如图，都不合理，请分别说明理由。①第1组：__________________________________________________;②第2组：__________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效

引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

引物的选择和设计例3：（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（

）A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoIC．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶B引物的选择和设计例4：(2021.湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（

）A.增加模板DNA的量

B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间

D.提高复性的温度BPCR的应用031、利用引物添加酶切位点2、重叠延伸PCR（融合PCR）3、定点突变-重叠延伸PCR/大引物PCR技术4、反向PCR5、不对称PCR6、巣式PCR7、实时荧光定量PCR技术8、RT-PCR技术1、应用-利用引物添加酶切位点53535353第一轮第二轮1、应用-利用引物添加酶切位点

例1：引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如图所示，X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的()D解析：DNA聚合酶能特异性地复制处于两个引物之间的的DNA序列。引物中的X经过扩增最终成为目标序列的一部分。1、应用-利用引物添加酶切位点

例2：基于嗜热厌氧杆菌的特殊代谢能力（图a），研究人员构建了双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）的过量表达载体，图b为构建表达载体时所需的关键条件。①为保证双功能醇醛脱氢酶基因（Adh）能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和引物2，其中引物1的序列为5`—

—3`。GGTACCGTACCTTTGT解析:左边加KpnI识别序列，右边加XbaI识别序列1、应用-利用引物添加酶切位点例3(难):大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y－GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。1、如图所示Y基因序列为转录的____________(填“模板链”或“非模板链”)。2、已知EcoRⅠ识别序列为5′－GAATTC－3′，BamHⅠ识别序列为5′－GGATCC－3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5′－__________________－3′(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。非模板链GGATCCATGTTCGGATCCATGTTC2、重叠延伸PCR（融合PCR）(1）原理：拼接两个或多个DNA序列，可以使用末端可以连接的特殊引物。设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。(2)用途：可以将几段较小的DNA按照顺序连接形成较大的DNA，且不需要限制酶。(3)特点：不需要限制性内切核酸酶和连接酶的处理，用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，操作非常简便，利用这一技术很快获得利用限制性内切核酸酶消化的方法难以达到的产物，可用于大片段基因的人工合成，且成功率非常高。2、重叠延伸PCR（融合PCR）例1：某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是（

）A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链D.杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物C2、重叠延伸PCR（融合PCR）例2：

重叠延伸PCR技术是一种通过核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。过程如下图，下列叙述不正确的是（

）A．引物中G、C的含量越高，复性温度越高；当设置温度过低时可能导致非特异性条带增多B．第一阶段中引物2和引物3容易发生碱基互补配对，因此两者应置于不同反应系统中C．加入引物1、2的反应系统和加入引物3、4的反应系统中各进行一次PCR，共产生4种DNAD．引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制C3、定点突变（1）概念：将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删除，导致基因中的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。

3、定点突变-重叠延伸PCR

3、定点突变-重叠延伸PCR例1：重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(

)A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系

以提高扩增效率B．过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物C．过程②的产物都可以完成延伸过程D．若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通

用引物RP2D3、定点突变-重叠延伸PCR例2：水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过__________________________来完成。(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。改造基因(基因定点突变)或C－GT－AA或G

3、定点突变-重叠延伸PCR例2：水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________________________________________________________________________________________。(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_________________________________________________。3引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段3、定点突变-大引物PCR技术②大引物PCR技术：需要用到三种引物进行两次PCR，这三种引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一次PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二次PCR利用第一次扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。该技术的流程如图所示：

3、定点突变-大引物PCR技术例1.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是(

)A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才

能进行转录和翻译D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑

不同的复性温度B3、定点突变-大引物PCR技术例2：PCR技术不仅可以扩增目的基因，还可用于定点诱变目的基因等。大引物PCR就是一种定点突变技术。大引物PCR需要用到引物进行两次PCR，其操作步骤为∶①根据目的基因序列设计引物，得到两个常规引物，分别为常规上游引物和常规下游引物；②根据突变碱基所处序列位置设计突变上游引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置③由突变上游引物与常规下游引物进行第一次PCR反应得到下游大引物；④用得到的下游大引物中和另一个常规上游引物进行第二次PCR扩增，得到突变目的基因序列。(1)PCR扩增的第一步是使双链模板DNA变性。DNA中G+C的含量与变性要求的温度有关，DNA中G+C的含量越多，要求的变性温度越高。其原因是

。该PCR扩增技术所需的基本条件是

种引物、原料、模板、

。(2)在第一次PCR反应中，形成图示双链DNA至少要经过

次复制。第一次PCR的产物DNA的

条链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是

。DNA中G和C之间有三个氢键，A和T之间只有两个氢键，G+C含量越多，其氢键越多，变性时所需温度越高

3

耐高温的DNA聚合酶2

一

目的性强、突变概率高4、反向PCR4、反向PCR情境素材：反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？

引物1和引物4。4、反向PCR情境素材：反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。(2)上述PCR产物是环状DNA分子还是链状DNA分子？

链状DNA分子。(3)上述PCR过程中使用了哪些酶？

限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。4、反向PCR例1：(2025·广东江门期中)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是(

)A.酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列B.PCR技术的操作步骤依次是高温变性、低温复性、中温延伸C.图中引物应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对D.PCR扩增时，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状D4、反向PCR例2：（2020·江苏·高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoRI酶切为例）：请据图回答问题：（1）步骤I用的EcoRI是一种

酶，它通过识别特定的

切割特定位点。（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成

；PCR循环中，升温到95℃是为了获得

；TaqDNA聚合酶的作用是催化

。【答案】（1）限制性核酸内切（或限制）

核苷酸序列

（2）磷酸二酯键DNA单链

以DNA为模板的DNA链的延伸4、反向PCR（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是

（从引物①②③④中选择，填编号）。名称DNA序列(省略号处省略了部分核苷酸序列)已知序列5′-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3′3′-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5′引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′②④4、反向PCR(4)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(省略号处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。A.5′-AACTATGCG……AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG……CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT……TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC……CGAGTAC-3′B4、反向PCR例3：（2025年山东）

种子休眠是抵御穗发芽一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。（1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为_____。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和_____对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是_____。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_____进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为_____bp，则一定为正向重组质粒。

①.复制原点

②.XbaI③.DNA聚合酶

④.SmaI和SpeI⑤.550bp4、反向PCR例3：（2025年山东）

种子休眠是抵御穗发芽一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。（2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。

①.4②.环化

③.测序和序列比对

4、反向PCR例3：（2025年山东）

种子休眠是抵御穗发芽一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。不能5、不对称PCR原理：不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链DNA。应用：产生单链DNA，用于做测序模板、杂交探针等。5、不对称PCR例1．不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的技术。这两种引物一少一多，比例一般为1：50~1：100，分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，在最初的10~15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生大量单链ssDNA。下列说法错误的是（

）A．最初的10~15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长B．非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度C．限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量D．所得ssDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用B5、不对称PCR例2．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列有关叙述错误的是（

）

A．限制性引物和非限制性引物均可与模板DNA单链结合B．不对称PCR循环6次需要消耗（26-1）a个限制性引物C．最后获得的ssDNA中不含非限制性引物D．子链的延伸都是从两种引物的3'端开始的C6、巣式PCR原理：首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。6、巣式PCR例:1：为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(

)A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高D7、实时荧光定量PCR技术病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。TaqMan探针为一寡核苷酸序列，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。7、实时荧光定量PCR技术在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到。7、实时荧光定量PCR技术通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越

，说明病毒核酸浓度越高。思考：平台期出现的原因？可能是试剂盒中的原料、引物、探针被消耗完了小7、实时荧光定量PCR技术例1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加