多索茶碱注射液含量测定方法研究

多索茶碱注射液含量测定方法研究摘要采用高效液相色谱法对多索茶碱注射液的含量进行测定。采用辛烷基硅烷键合硅胶为C-18色谱柱填充剂；以水-乙腈（85:15）作为流动相；检测波长为273nm，柱温为30℃。通过验证其专属性、进样精密度、重复性、中间精密度、溶液稳定性、定量限、检测限、准确度等测定其含量是否符合标准。本文通过验证多索茶碱注射液含量测定方法，来确认所采用的分析方法是否符合检测多索茶碱注射液仿制药项目的要求。关键词：多索茶碱；注射液；含量；高效液相色谱

ResearchonTheContentDeterminationofDoxofyllineInjectionbyHPLCAbstractThecontentofdoxofyllineinjectionwasdeterminedbyHPLC.OctylsilanebondedsilicagelwasusedasthefillerofC-18chromatographiccolumn.Mobilephasewaswater-acetonitrile(85:15).Thedetectionwavelengthwas273nmandthecolumntemperaturewas30℃.Theverificationofitsspecificity,injectionprecision,repeatability,intermediateprecision,solutionstability,quantitativelimit,detectionlimit,accuracyandsoonwereusedtodeterminewhetheritscontentmeetingthestandard.Inthispaper,thecontentdeterminationmethodofdoxofllineinjectionwasverifiedtoconfirmwhethertheanalyticalmethodmeetingtherequirementsofthegenericdrugprojectofdoxofllineinjection.Keywords:doxotheophylline;injection;content;highperformanceliquidchromatography

前言呼吸内科疾病是现在常见的疾病其中支气管哮喘的发病率逐年上升。该种疾病是由多种细胞及细胞因子等参与的慢性的炎症性疾病[1]，主要表现为炎症反应过度激活及免疫应答紊乱[2]。支气管哮喘的发病机制较为复杂,症状明显,易复发[3]。患者主要表现为反复发作的喘息、气促、胸闷和（或）咳嗽等，多发生在夜间或凌晨[4]。支气管哮喘的病程长，病情呈进行性发展，可逐渐发展为肺气肿等疾病。长期发作时会并发慢阻肺、肺心病等疾病。若未得到及时的治疗，患者可能会出现呼吸衰竭，因此支气管哮喘严重威胁到了人们的生命健康[5]。据统计，目前全球共有3亿多哮喘患者，且儿童的发病率逐年增高，受到了社会各界的关注。因此用于哮喘的治疗而药物的开发与研究得到了社会各界的广泛关注，并且成为了国内外许多企业的研究热点。多索茶碱适用于治疗支气管哮喘、喘息性慢性支气管炎以及其他支气管炎所引起的呼吸困难[6]。多索茶碱为新型甲基黄嘌呤类衍生物[7]，与传统的茶碱相比,多索茶碱对部分受体的亲和力较弱，不影响钙内流等特点,因此多索茶碱不影响心率和中枢神经系统的功能以及胃分泌,且具有良好的安全性和耐受性[8]。并且对中枢及心血管系统所造成的影响小，临床应用时一般不会引起肺外系统如中枢、心血管的不良反应[9]。据资料表明，在治疗肺部相关疾病时加入多索茶碱，可以使疗效增加，不良反应降低，是一种可以代替传统茶碱类药物治疗支气管哮喘的药物。因此多索茶碱注射液及其同类药物与传统茶碱类药物相比具有更好的市场优势，公司通过对各方面的考察与研究，开展了多索茶碱注射液仿制药研究的项目。目前，本公司根据制剂的制备工艺和《中国药典》及其他资料表明可以通过高效液相和薄层色谱法、气相色谱法等方法对多索茶碱注射液的含量进行测定。许多相关文献及药品标准中一般对多索茶碱注射液中多索茶碱的测定采用的是液相色谱法[10]。高效液相色谱法可以很好地分离多索茶碱及其副产物，且采用高效液相色谱法测定多索茶碱的含量时辅料不会对多索茶碱的测定产生干扰[11]。并且考虑到高效液相色谱法较其他色谱法精确，稳定可准确定量的特点[12]，故初步确定了多索茶碱注射液含量的检测方法，照高效液相色谱法（通则0512）测定[13]，用高效液相色谱法测定多索茶碱的原料药及其制剂的含量，可以消除原料药中的杂质、制剂中的附加剂等干扰[14]。本文则对此方法进行验证，通过高效液相色谱法进行方法验证是为多索茶碱注射液含量的检测提供更准确的依据。

1多索茶碱注射液简介1.1概述中文名：多索茶碱英文名：Doxofylline分子量：266.25分子式：C11H14N4O4化学名：1,3-二甲基-7-(1,3-二氧环戊基-2-基)甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮其结构式见图1。图1多索茶碱结构式1.2性状固体为白色结晶状，溶于水、丙酮，难溶于乙醚。注射液为无色澄明液体。1.3适应症支气管哮喘、喘息性慢性支气管炎等急慢性肺部疾病。1.4药理作用多索茶碱的作用机制与茶碱类似，但多索茶碱在改善肺功能，降低不良反应等方面比传统茶碱类药物更显著[15]。多索茶碱通过抑制中枢和外周的磷酸二酯化酶，提高细胞内cAMP水平，从而起到舒张支气管平滑肌及抑制气道炎症的作用[16]。1.5不良反应及禁忌可出现中枢神经系统症状如震颤、失眠等；偶见心悸一般发生在大剂量静脉给药之后静脉给药后可能发生嗜睡。胃肠道症状一般出现恶心、呕吐、消化不良等。静脉滴注可引起皮肤的过敏反应。使用多索茶碱的同时服用大环内酯类药物和氟喹诺酮类药物等都可使茶碱类药物血清药物浓度升高[17]，因此应适当降低多索茶碱注射液的用量。多索茶碱不能和黄嘌呤类药物同时使用，在注射多索茶碱期间禁止与含有咖啡因的药物同服。2药物的含量是指药物中所包含的有效成分的量的多少并且是否符合国家有关规定。是评价一个药物是否有效的标准之一。测定药物的含量时，选用的方法应根据药物本身特性考虑，要选择符合该药物要求的方法。原料药的含量测定时，应选用快速、操作简便的方法测定。药物的含量一般可以采用容量分析法、高效液相色谱法，紫外分光光度法等。因此在使用上述方法测定多索茶碱原料药及其制剂时，紫外分光光度法一般只适用于多索茶碱片的含量测定，此方法具有简便、快速、重现性好、准确性高等优点[18]。而高效液相色谱法则一般适用于多索茶碱注射液的含量测定。3高效液相色谱法在测定药物含量方面的应用高效液相色谱技术（Highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）而药物含量测定主要采用的方法是高效液相色谱技术。HPLC被广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面,已成为天然药物有效成分分离、分析最重要的方法之一[19]。高效液相色谱技术主要是对试样进行高压处理，利用液体的特性对试样进行分析，并和固定色谱进行对照，从而实现对试样的检测[20]。发展初期主要被应用于化学行业各组分的分离中。随着色谱技术与科技的不断发展，人们慢慢地将分离技术与检测系统结合使用，使这种分离检测技术具有高灵敏度、高选择性、简单快捷的特征，目前广泛的被应用于各类药物含量检测中。本次研究针对本公司研发的多索茶碱注射液利用高效液相色谱仪进行含量方法学验证。4多索茶碱注射液含量方法验证4.1专属性专属性是指在含有其他物质的存在的情况下，所测样品采用一定的分析方法可以快速地检测出被测成分的能力。主要考察在其他物质存在下会不会影响被测成分的测定结果。4.1.1干扰试验用天平准确称量多索茶碱对照品，称量的样品放到容量瓶中，再向瓶中加适量的水使对照品溶解，配制成每毫升的溶液中应该含有多索茶碱0.2mg。用天平称取多索茶碱杂质适量于容量瓶中，加适量的水溶解杂质并摇匀即可作为杂质定位溶液，杂质定位溶液中每毫升溶液中约含0.1mg杂质。用移液管移对照品4ml、杂质定位溶液1ml，混匀，作为混合溶液。量取对照品溶液4ml、杂质定位溶液1ml，混匀，作为混合溶液。实验结果如图2所示，实验结果表明空白溶剂、已知杂质均不干扰多索茶碱含量的测定。图2多索茶碱对照品4.1.2线性考察线性考察是指采用的分析方法所测得的实验结果符合要求的程度，实验结果的浓度变化范围具有线性特征。线性考察结果可用作图法或线性回归方程表示。用天平准确的称量多索茶碱对照品放到容量瓶中，加适量的水溶解对照品作为对照品贮备液，配制成每毫升的溶液中应该含有多索茶碱0.4mg。用移液管准确的移取对照品贮备液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml到10ml的容量瓶中，加适量的水到容量瓶的刻度，稀释制成60%、80%、100%、150%、200%的溶液，摇匀即得线性溶液。专属性项下多索茶碱线性方程为y=40.2971x+2.5057，r=1，本品在0.123μg/ml～0.287μg/ml范围内线性关系良好。4.1.3定量限 定量限是指为了得到精准确切的实验结果，定性定量的检测被检成分的最小量。该检测项是以检测该样品能不能灵敏的检测此实验项目为目的。103。专属性项下多索茶碱定量限要求为0.6ng，相当于供试品浓度的0.15%，连续进样，保留时间的RSD小于1.0%，峰面积的RSD小于10.0%。4.2精密度考察精密度考察是指连续测量多次后能否再现的能力，其确保了检测能力的高度准确。准确度高的前提是精密度高但精密度高的同时准确度不一定高。4.2.1进样精密度进样精密度是指连续多次进样后所测得的精密度。用天平准确的称取多索茶碱对照品，加适量的水稀释可以得到对照品溶液，所得的对照品溶液中每毫升溶液应该含有多索茶碱0.2mg。多次进样。精密度项下多索茶碱进样精密度要求主峰保留时间的RSD为0.11%，小于1.0%，主峰峰面积的RSD为0.11%，小于1.0%，进样精密度良好。4.2.2重复性重复性是指在一定且相同的检测条件下相同的样品可以反复多次进行检测所得到的实验结果。使用天平准确地称取多索茶碱对照品，放到容量瓶中，加适量的水溶解可得多索茶碱对照品（平行2份），用天平精确地称取多索茶碱供试品，放到容量瓶中，加适量的水并摇匀（平行6份）即得多索茶碱供试品溶液。精密度项下多索茶碱重复性平行试验6份样品的含量测定结果平均值为99.33%，在98.0%～101.0%范围内，RSD为0.05%，小于1.0%，表明方法重复性良好。4.2.3中间精密度中间精密度是指在不同的检测条件下相同的样品可以反复多次进行检测所得到的实验结果，它的目的是为了考察多索茶碱的中间精密度是否符合要求。用天平称取多索茶碱对照品，放到容量瓶中，用适量的水溶解得对照品（平行2份）。用天平称取多索茶碱供试品，放到250ml的容量瓶，加入适量的水溶解并定容可得多索茶碱供试品（平行6份）。精密度考察项下多索茶碱中间精密度12份样品测定含量没有明显差别，平均值为99.3%，RSD为0.11%，小于2.0%时中间精密度满足含量测定要求。4.3滤膜干扰考察过滤多索茶碱注射液后对其含量测定是否有干扰。要求是滤膜干扰小于0.5%，表明滤膜对多索茶碱含量测定没有明显干扰。取重复性项下的供试品溶液，分别弃去一定量的初滤液。分别精密量取以上溶液各20μl，注入液相色谱仪，考察该含量测定方法的精密度。计算公式：滤膜吸附=（未过滤峰面积-弃初滤液后峰面积）使用高效液相色谱法测定多索茶碱的含量时滤膜干扰小于0.5%，表明滤膜对多索茶碱含量测定没有明显干扰4.4溶液稳定性溶液稳定性是指当外界条件不改变时溶液中的有效成分不会析出。用天平称取供试品、对照品放到容量瓶中，加入适量的水使供试品与对照品溶解。分别在室温下放置一天，每间隔两小时取一次样。多索茶碱注射液含量方法研究中溶液稳定性的要求本品含量测定对照品溶液、供试品溶液于室温下放置24小时，主峰峰面积变化率均小于0.5%。说明多索茶碱对照品与供试品溶液于室温下放置，在24小时内稳定，适合样品常规检测的要求。4.5准确度准确度指在特定的实验条件下经过多次反复的测定同一个样品得到的平均值与真实值相比较来确定与标准要求符合的程度，以误差来表示。在平时的工作中，一般使用的是国家规定的方法进行对照试验，在没有相关的规定时，通常使用加入该待检样品的纯净物，采用回收试验来估计它的准确度。准确度所测得的数据与要求相符合的程度，反映了选用的分析方法是否符合这个样品测定的要求。用天平称多索茶碱对照品20mg放到容量瓶中加入适量的水溶解对照品作为对照品溶液（平行2份）。准确地称取多索茶碱对照品约16mg，放到容量瓶中加适量的水溶解供试品并摇匀作为80%的供试品溶液（平行3份）。精确地称取多索茶碱对照品约20mg，用上述方法配置作为100%供试品溶液（平行3份）。精确地用天平称取多索茶碱对照品约24mg，加适量的水至容量瓶刻度溶解并摇匀即为120%供试品溶液（平行3份）。多索茶碱注射液含量方法验证中准确度要求9份样品回收率均在99.0%～101.0%之间，平均值为99.7%，RSD%为0.27，小于1%，结果显示方法准确度良好。4.6耐用性试验耐用性实验考察多索茶碱注射液在色谱条件有少量变化时，对多索茶碱含量测定的影响程度。在规定色谱条件下进行测定多索茶碱的含量。耐用性实验色谱条件见表1。表1多索茶碱含量测定耐用性试验条件柱温变化流速变化波长变化流动相有机相比例变化换用不同品牌色谱柱25℃1.2ml/min278nm乙腈-水（13:87）AgilentSB-C8250×4.6mm，5μm35℃0.8ml/min268nm乙腈-水（17:83）Kromasil100-5C8250×4.6mm，5μm取多索茶碱对照品适量，置于量瓶中，用水稀释，摇匀，得对照品溶液。量取本品适量，置量瓶中，用水稀释后摇匀即为供试品溶液。多索茶碱注射液含量方法验证中耐用性要求在对色谱条件进行微小变化时（色谱柱、流速、波长、柱温、流动相比例），除保留时间和峰面积略有差异外，含量测定结果均无明显变化，主峰理论塔板数均符合规定，表明该色谱条件具有良好的耐用性。5结论采用高效液相色谱法测定多索茶碱注射液含量时专属性强，线性良好，精密度良好，耐用性良好，灵敏度高，溶液在室温放置24h内稳定性良好，因此高效液相色谱法可以作为多索茶碱注射液的含量检测方法。6国内外研究现状及水平展望多索茶碱作为新型甲基黄嘌呤衍生物，临床主要用于慢性支气管炎和支气管哮喘[21]，其作用机制是通过抑制平滑肌细胞内的磷酸二酯酶等作用松弛平滑肌[22]，来达到松驰支气管平滑肌的作用，从而达到抑制哮喘的目的。许多资料表示在治疗肺部疾病的同时加入多索茶碱的使用，使其疗效更加明显、引起的不良反应更少[23]。并且多索茶碱注射液与其他治疗哮喘的药物相比更加安全可靠，适用于临床用药,止咳效果是其他治疗哮喘的药物的效果的10-15倍[24]。虽然茶碱仍然是治疗哮喘等疾病时使用最多的处方药物之一[25]，但随着医疗技术的快速发展，新技术的应用范围也不断扩大,多索茶碱仍然有较大的发展潜力和应用前景。

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