CN115917010B 结直肠癌的早期检测、预测治疗反应和预后之方法 （爱立基生医股份有限公司）

2022.10.28PCT/US2021/029965202WO2021/222621EN2021.11.04楼KR20140123777A,2014.10.23治疗反应及预后的新颖表观遗传生物标记物集24.如权利要求2所述的用途，其中所述检测进一步包含若各基因存在高甲基化则定义分数为1且若各基因缺乏高甲基化则定义分数为0以及将5.如权利要求1所述的用途，其中所述个体之所7.如权利要求1所述的用途，其中当用于测定所8.如权利要求1所述的用途，其中当用于测定所述个体9.如权利要求1所述的用途，其中针对包含MROH6的所述标靶DNA序列之所述甲基化特异性引子包含SEQIDNO:5及6的当用于测定所述个体中之TMEM240之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于50时，指示高甲当用于测定所述个体中之TMEM240之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲针对TMEM240的所述标靶DNA序列之所述甲基化特异性引子包含引子对SEQIDNO:1及针对BEND5的所述标靶DNA序列之所述甲基化特异性引子包含引子对SEQIDNO:8及9性探针包含SEQIDNO:4之序列；且针对BEND5的所述标靶DNA序列之所述甲基化特异性探针包含选自由SEQIDNO:12至13组成之群的序列。3用于检测TMEM240之标靶DNA序列之甲基化状态的序列是引子对SEQIDNO:1及2或SEQ用于检测MROH6之标靶DNA序列之甲基化状态的序列是引用于检测BEND5之标靶DNA序列之甲基化状态的序列是引子对SEQIDNO:8及9或SEQ及MROH6之标靶DNA序列之甲基化状态的甲基19.如权利要求18所述的套组，其中针对TMEM240的所述标靶DNA序列之甲基化特异性性引子对为引子对SEQIDNO:8及9或SEQIDN20.如权利要求18所述的套组，其进一步包含用于检测针对MROH6的所述标靶DNA序列21.如权利要求20所述的套组，其中针对MROH6的所述标靶DNA序列甲基化特异性探针22.如权利要求18或19所述的套组，其中所述套组进一步包含用于检测针对TMEM240、所述标靶DNA序列之甲基化特异性探针为特异性探针SEQIDNO:4，针对BEND5的所述标靶DNA序列之甲基化特异性探针为特异性探针SEQIDNO:12或13；且针对MROH6的所述标靶DNA序列之甲基化特异性探针为特异性探针SEQID4[0002]本申请主张2020年4月29日提交的美国临时专利申请入其全部内容。所述ASCII副本创建于2021年4月29日，名为G4590_08300PCT_[0005]本揭示关于用于预测结直肠癌之风险或易感性的表观遗传生物标记物。特定言[0007]甲基化DNA已作为大部分肿瘤类型之组织中的一类潜在生物标记物加以研究。在提供藉由测定癌症组织中之miR_133a含量来评估化学疗法(诸如奥沙利铂疗法)在结直肠癌患者中之有效性可能性以及其生存前景的方法。US20200377959揭示一种检测(例如筛5(b)测定所述生物样品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基性引子分析生物样品中之标靶DNA序列及对照DNA序列[0014]在一个实施例中，个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化是藉由比较标靶方法，其包含(a)提供来自个体之生物样品，所述生物样品包含含有TMEM240或其片段或MROH6或其片段的标靶DNA序列；及(b)使用标靶DNA序列甲基化特异性探针或标靶DNA序列甲基化特异性引子测定所述生物样品中之标靶DNA序列及对照DNA序列的甲基化状态；(c)量测标靶DNA序列相较于对照DNA序列的相对甲基化状态；(d)当相对甲基化状态存在高甲中，MROH6或其片段之甲基化状态比对照DNA序列之甲基化状态高或低约44倍指示结直肠[0017]在一些实施例中，当用于测定人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚于测定人类个体中之TMEM240或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于45时，指示高甲基化；或当用于测定人类个体中之MROH6或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值[0019]用于测定TMEM240或其片段中之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性引子之某些699％或更高百分比的一致性。在一些实施例中，用于测定MROH6或其片段之甲基化的标靶中，用于测定TMEM240或其片段之甲基化的标靶DNA序列甲基化特异性探针具有与选自由甲基化特异性探针与SEQIDNO:7之序列具有约8[0021]本文所述之标靶DNA序列的某些实施例包括DNA序列之以下组合中的任一者：BEND5或其片段与SMAD3或其片段；TMEM240或其片段、MROH6或其片段与SMAD3或其片段；中之BEND5或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值小于实施例中，当用于测定人类个体中之SMAD3或其片段之甲基化状态的聚合酶链反应Ct值高或低甲基化则定义分数为1且若各基因或其片段缺乏高甲基化或低甲基化则定义分数为07基化特异性引子或其任何组合进一步用于测定以下一或多种DNA序列或其任何组合的甲基序列甲基化特异性探针具有SEQIDNO:12或13的序特异性探针具有SEQIDNO:16的序之组合的甲基化状态具有约100％灵敏度及约100％特异性及约100％[0035]在另一实施例中，本文所述之方法进一步包含将抗结直肠癌药剂投与个体的步[0036]本揭示提供一种检测个体之结直肠癌之易感性或预测个体之结直肠癌之可能性、品中之包含TMEM240或其片段或MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态，其中所述个体之标靶DNA序列存在高甲基化或低甲基化指示结直肠癌之易感性、可能性、不良治疗反8一致的标靶DNA序列甲基化特异性引子或序列与SEQIDNO:4至少85％一致的标靶DNA序列甲基化特异性探针测定TMEM240或其片段的甲基化状态，及使用序列与SEQIDNO:5或6至少85％同源的MROH6甲基化特异性引子或序列与SEQIDNO:7至少85％同源的MROH6序列甲[0038]在本揭示之一些实施例中，标靶DNA序列进一步包含一或多种选自由以下组成之[0039]本揭示提供一种经分离之核酸分子，其具有选自由SEQIDNo:1至16组成之的接附子，以及聚核苷酸(例如作为可检测标记[0041]本揭示提供用于检测TMEM240或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测TMEM240或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQIDNO:4或与其具有至少85％一致性的序列。[0042]本揭示提供用于检测MROH6或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性MROH6或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQIDNO:7或与其具有至少85％一致性的序列。[0043]本揭示提供用于检测BEND5或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性或与其具有至少85％一致性的序列。本揭示提供用于检测BEND5或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性探针，其包含SEQIDNO:12或13或与其具有至少85％一致性的序列。[0044]本揭示提供用于检测SMAD3或其片段之甲基化状态的标靶DNA序列甲基化特异性检测包含TMEM240或其片段及MROH6或其片段之标靶DNA序列的甲基化状态。在本揭示的一片段及MROH6或其片段之标靶DNA序列的9[0048]图1A至H分别显示基因之靶核酸及启动子、外显子及基因本体区之甲基化状态在[0049]图2A至D显示健康个体与结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标[0050]图3显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物TheoryandROCAnalysis,AcademicPressRNA可由全长编码序列编码或由编码序列之任何部分编码，只要保留全长多肽或多肽片段指DNA中之任何区段，其已转录，但藉由与其任一侧之外显子剪接在一起而自转录物内移因之基因体DNA内的介入序列，其被外显子序列夹持且通常在其5'及3'边界处具有GT及AG[0065]用于测定核酸及氨基酸序列一致性的技术包括测定基因之mRNA的核苷酸序列及/酸相对于核苷酸或氨基酸相对于氨基酸精确对应基酸)可藉由测定其一致性百分比来比较。两个序列分比为两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列之长度且乘以NucleicAcidHybridization:APracticalApproach,编者B.D.Hames及S.J.Higgins,相应CpG二核苷酸处发现之核酸分子甲基化核苷酸碱基的量，测试DNA样品之DNA序列内之一个或多数个CpG二核苷酸处之核酸分子甲基化核苷酸碱相应CpG二核苷酸处发现之核酸分子甲基化核苷酸碱基的量，测试DNA样品之DNA序列内之一个或多数个CpG二核苷酸处之核酸分子甲基化核10个碱基。所述术语可指长度不确定之RNA或DNA分子。所述术语包括单股及双股形式之细胞死亡之平衡失调。在许多疾病过程(诸如癌症基化典型地发生于CpG岛中的多个CpG位点，所述CpG位点存在于蛋白质编码基因之启动子[0081]在本揭示中，量测生物样品中之标靶DNA序列或其片段的甲基化状态以检测结直DNA序列的甲基化状态以检测人类个体之结直肠癌或检测人类个体之结直肠癌之易感性或[0082]TMEM240编码脑及小脑中所发现之含跨膜域蛋白质跨膜蛋白240。发现TMEM240之[0083]MROH6基因编码大师热(maestroheat)样重复家族成员6。与MROH6相关之疾病包[0084]BEND5基因编码充当转录抑制因子的含BEN域因子5。在一个优选实施例中，标靶[0085]SMAD3基因编码与转型生长因子_β有关的SMAD家族成及依赖于检测扩增之DNA的其他方法。术语“MethyLightTM”指基于荧光之实时PCR技术。引子涵盖的甲基化特异性阻断探针(在本文中亦称为阻断剂)能够实现核酸样品的甲基化[0089]术语“Ms_SNuPE”指甲基化敏感性单核苷酸引子延长(Methylation_sensitiveSingleNucleotidePrimerExtension)。MsSNuPE描述于Gonzalgo及Jones,Nucleic[0093]在本揭示之一个实施例中，可以使用能够扩增本文所述基因之甲基化CpG的标靶DNA序列甲基化特异性引子。标靶DNA序列甲基化特异性引子在与基因之甲基化CpG杂交的列甲基化特异性引子包含与选自由如表1中所示之以下序列组成之群之序列具有约85％、[0094]在本揭示之一个实施例中，可以使用能够与本文所述基因之甲基化CpG杂交的标靶DNA序列甲基化特异性探针。能够与基因之甲基化CpG杂交的标靶DNA序列甲基化特异性99％或更高百分比之同源性的序列。生物标记物含量的CT扫描)、但其癌症分期或指示癌症之甲基化基因之存在或不存在未知[0103]在一些实施例中，本文所揭示之一或多种生物标记物在不同样品中显示至少p<[0104]在一些实施例中，本文所述之DNA序列中之表观遗传生物标记物的高甲基化状态[0105]在一些实施例中，本揭示提供具有选自由SEQIDNo:1至16组成之群之发，所述套组包含具有选自由SEQIDNo:1至4或5至7组成之群之序列的经分离之核酸分与作为标记物序列产物的序列杂交而设计的聚核苷酸(若所述标记物序列未发生甲基化(例如含有至少一种C_U转化))，及/或甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶。在一些情况扩增DNA区域或其一部分杂交的可检测地标记之聚核苷酸。套组进一步可包含甲基化依赖及聚核苷酸(例如可检测地标记的聚核苷酸)以定量至少一个胞嘧啶之已转化甲基化序列及或已转化未甲基化序列在本文所述之表观遗传生物标记物之DNA区域附子，以及聚核苷酸以定量本文所述之表观遗传标记物之DNA区域之至少一部分的复本数[0113]尽管本揭示已藉由例示性实施例描述，但熟习此项技术者可提出各种变化及修[0117]使用ETDA_K2管及专门为了活体外诊断性ccfDNA测试而设计的PAXgene血液ccfDNA(循环游离DNA)管(Qiagen,Hilden,德国，768165)收集血液样品。使用ETDA_K2管来自各样品之上清液转移至新离心管中且在4℃下以6000×g离心30分钟且随后在_80℃下样品之血浆分成1.6mL等分试样且立即在_80℃下冷冻直至进一步使用。[0119]西方群组数据是基于由癌症基因体图谱(TCGA)研究网络自基因体数据共享用NanoDropND_1000光谱亮度计(NanoDropTechnologiesInc,Wilmington,DE,USA)量测[0123]使用MagMAX游离DNA分离套组(ThermoFisherScientific,Austin,TX,USA)或捕血浆样品提取循环游离DNA(cfDNA)。ccfDNA样品具有140与200bp之间的清晰片段尺寸峰。DNA分离套组提供最高产量及低分子量溶离份。立即在2小时内自10mL周边血液分离出血品之基于磁珠的DNA提取同时自动操作。如随MagMAXTM游离DNA分离套组(ThermoFisherScientific,Austin,TX,USA,A29319)供应的说明书手册中所述调整工作流程。自1.6mL血酸氢钠(6M)及氢醌(10mM)一起在60℃培育箱中培育30分钟。吾等使用60μLccfDNA用于亚用经亚硫酸氢盐转化的所溶离ccfDNA进行甲基化特异制造商说明书执行自动化ccfDNA提取方法。工作流程遵循随着Labturbo循环DNA小型套组μL分子生物学级水(46_000_CM,Corning,NY,USA)中溶离。用于全基因体甲基化分析的MethylationEPICBeadC比较验证。使用MethylationEPICBeadChip数组(Illumina,SanDiego,CA,USA)执行全基因体甲基化分析。使用EpiTectFastDNA亚硫酸氢盐套组(QIAGEN,Bonn,德信号强度相对于甲基化与未甲基化信号输出总和之比率，将各CpG位点的甲基化分数呈现[0130]根据制造商推荐的方案对DNA进行亚硫酸氢盐转化之后，使用TaqMan定量甲基化特异性PCR(qMSP)联合LightCycler96(RocheAppliedScience,Penzberg,德国)来量测TMEM240、MROH6、BEND5及SMAD3之DNA甲基化水平。使用SensiFASTTM探针No_ROX套组[0132]使用SPSS(IBM,Armonk,NY,USA)执行皮尔森卡方检验(Pearson'schi_squared逐步分类方法(Kang'snonparametricstepwiseclassificationmethod)评价鉴别结直[0135]基于Illumina甲基化450K数组之数据的β值由癌症基因体图谱(TCGA)研究网络产0.500.730.530.09[0139]图1显示靶核酸及基因之甲基化状态(β值)在肿瘤组织与相邻正常组织(n＝97)之[0140]实例2：健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物[0142]根据以下准则处理获自qMSP分析的数据。若qMSP之Ct值就循环甲基化TMEM240基[0144]图2显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状态的早期检测差异。图3显示健康个体及结直肠癌患者之血浆样品中之靶基因之(ROC)曲线分析指示结直肠癌患者及健康个体中之靶基因之表观遗传生物标记物甲基化状445555666677