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ICS65.020.30CCSB43NXSLXTechnicalcodeofgenerationforpreparationofgene-editedbovinefibroblastsIT/NXSLX0208—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏大学提出。本文件由宁夏饲料工业协会归口。本文件起草单位：宁夏大学、宁夏农林科学院动物科学研究所、宁夏大北农科技实业有限公司、海原县科学技术局、固原富民农业科技发展有限公司。本文件主要起草人：魏大为、杨东梅、张久盘、马云、张娟、岳家琪、蔡蓓、宋雅萍、张令锴、胡亚美、聂路玮、姜超、刘源、田平、何学良、咸海龙、焦若普、龚红芳、马艺伦。1T/NXSLX0208—2025牛基因编辑成纤维细胞制备技术规程DB4403/T336DNA合成实验室环），2T/NXSLX0208—2025实验室需符合GB19489、GB/T27425、GB/T42微镜、离心机、水浴锅、超低温冰箱（-80℃)及液氮罐等基本设施。应具备独立的功能区：样本接收区、无菌操作区、细胞培养区细胞培养基（DMEM/Highglucose）、胎牛血基因编辑相关试剂（Cas9蛋白、gRNA、核转利用无菌器械剔除牛耳缘组织上的毛发，待PBS清洗3次后剪成约1mm³的小块。将组织块均匀贴附于细胞培养瓶底，间距约0.5-养1h待组织块略干燥后，轻轻加入细胞生长培养基（含10%FBS）继续培养。每天观察细3T/NXSLX0208—2025当原代成纤维细胞沿着组织块迁出并铺满瓶底约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代,相关基因编辑操作需符合GB/T45137和GB/T45列，设计并验证特异性gRNA及同源重组模板。取生长状态良好、处于对数生长期的3~5代成纤维细胞，消化制成单细胞悬液，计数并按照试剂盒说明书将CRISPR/Cas9编辑组件导入细胞。将转染后的细胞接种培养液中，于提取单细胞克隆基因组DNA，利用限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）或T7E1核酸酶切割法进行初步突变检测。随后对初筛阳性的克隆进行PCR扩增，并将产物送至测序，若有程序降温盒，将冻存管立即放入充满异丙醇的程序降温盒中，于-80℃冰箱中放4T/NXSLX0208—2025对扩增后的基因编辑细胞系进行核型分析，确认其染应对整个制备过程进行详细记录，包括但不管理（详见附录A-表1）、基因编辑实验操5T/NXSLX0208—2025间号间1234567896T/NXSLX0208—20

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