动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重实时荧光RT-PCR检测方法

T/CVMAxxx—xxxx

动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重

荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光RT-PCR检测

方法操作规程。

本文件适用于动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AIV-A：动物A型流感病毒（AnimalInfluenzaAVirus）

PRRSV-NA：北美种猪繁殖与呼吸综合征病毒（NorthAmericanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

PRRSV-EU：欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒（EuropeanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）

Cy5：荧光发光基团

Hex：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）

BHQ：荧光淬灭基团

5仪器和设备

1

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多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2℃~6℃和-20℃）、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩

涡器、移液器及吸头（至少包括10μL、200μL和1000μL三个量程）。

6试剂和耗材

6.1试剂

6.1.1病毒总核酸提取试剂TIANampVirusDNA/RNAKit或者其他等效核酸提取试剂。

6.1.2Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit或者其他等效多重荧光RT-PCR试剂。

6.1.3无水乙醇（分析纯）和75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC处理水配制）及实验用

水按照GB/T6682规定使用，-20℃预冷。

6.2阳性对照

动物A型流感病毒体外转录的非感染性RNA片段、北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒体外转

录的非感染性RNA片段，片段序列见附录A。

6.3阴性对照

动物A型流感病毒阴性样品、北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样品。

6.4引物和探针序列

引物和探针序列见附录B。

7病料采集和处理

病料采集和处理，按照NY/T541有关规定进行。

8病毒核酸提取

病毒核酸提取见附录C。

9荧光RT-PCR反应

9.1多重荧光RT-PCR反应体系

多重荧光RT-PCR反应体系组成见附录B。

9.2荧光RT-PCR反应程序

将反应体系混合液充分混合后，最后加入模板，瞬时离心，按照下列反应程序（见表1），进行一

步法荧光RT-PCR反应。

表1荧光RT-PCR反应程序

温度反应时间循环数

48℃10min1

2

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95℃10min1

5℃15sec

44

60℃45sec

9.3结果描述及判定

9.3.1质控标准

所有阳性对照（FAM、Cy5和Hex）均出现S形扩增曲线，阴性对照（FAM、Cy5和Hex）均无扩增

曲线且Ct≥40或者无值。满足此条件，视为此次试验有效。

9.3.2结果判断和鉴别

有扩增曲线，且Ct≤35，判定为核酸检测阳性；

有扩增曲线，但35<Ct<40，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单荧光RT-PCR方法确认；

如果Ct值仍然<40，则判定为核酸检测阳性，如果Ct值≥40或者无Ct值，判定为核酸检测阴性。

没有扩增曲线，或者Ct≥40，判定核酸检测阴性。

FAM阳性荧光信号表示PRRSV-NA核酸检测阳性，Cy5阳性荧光信号表示AIV-A核酸检测阳性，Hex

阳性荧光信号表示PRRSV-EU核酸检测阳性；两种阳性荧光信号表示对应的其中两种病毒核酸检测阳

性，三种阳性荧光信号表示AIV-A、PRRSV-NA和PRRSV-EU三种病毒核酸检测阳性。

10生物安全要求

样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照GB19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物

安全柜中进行，并做好个人防护。

3

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附录A

（资料性）

阳性对照和阴性对照的制备

A.1AIV-A-M基因参考序列

5＇-atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtatgttctctctatcgttccgtcaggccccctcaaagccgagatagcgcagagactcgaagat

gtgtttgcagggaaaaacaccgatcttgaagcactcatggaatggttaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgt

tcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatgggaatggtgatccgaacaacatgg

acaaagcggtcaaactgtacagaaaacttaaaagggaaataacattccacggggccaaagaagtagcgctcagttactctgctggtgcac

ttgccagttgcatgggcctcatatacaacagaatggggactgtcaccgctgaggtggcctttggtctagtatgcgcaacctgtgaacaaa

ttgctgattcccagcatcgatctcatagacaaatggtgacaacaaccaatccactaatcaggcatgagaacagaatggtactagccagca

caacagctaaagccatggaacaaatggctggatcaagtgaacaagcagcagaggctatggaggttgctagccaggctagacaaatggtac

aggcaatgagaacaattgggactcaccctagttccagtgctggtctaaaagatgatcttcttgaaaatctacaggcctatcagaaacgaatgggagtgca

aatgcaacgattcaagtgatcctctcattgctgccgcaagcatcattgggattttgcacctgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcat

ttaccatcactttaaatatggtcgaaaaagagggccttctacggaaggagtgccggagtccatgagggaagaatatcggcagaaacagca

gagtgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagtgctagagtaa-3＇

A.2PRRSV-NA株N基因参考序列

5‘-atgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgcc

aaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccg

gagaagccccatttccctctagcgactgaagatgacgtcaggcatcactttacccctagtgagcggcaattgtgtctgtc

gtcgatccagactgccttcaatcagggcgctggaacttgtgccctgtcagattcagggaggataagttacactgtggagt

ttagtttgccgacgcaacatactgtgcgtctgatccgcgccacagcatcaccctcagcgtga-3＇

A.3PRRSV-EU株N基因参考序列

5‘-atggccggtaaaaaccagagccagaagaaaaagaaaagtacagctccgatggggaatggccagccagtcaatcaactgtgccagttgctg

ggtgcaatgataaagtcccagcgccagcaacctaggggaggacaggccaaaaagaaaaagcctgagaagccacattttcccctggctgct

gaagatgacatccggcaccacctcacccagactgaacgctccctctgcttgcaatcgatccagacggctttcaatcaaggcgcaggaact

gcgtcgctttcatccagtgggaaggtcagttttcaggttgagttcatgctgccggttgctcatacagtgcgcctgattcgcgtgacttctacatccgcca

gtcagggtgcaagttaa-3＇

4

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附录B

（资料性）

引物和探针序列

引物、探针的名称与序列见表B.1。

表B.1引物和探针序列

病原靶基因引物和探针序列

FP1CCAGCCWGTCAATCAGCTGT

FP2CCAGCCGGTCAATCAGCT

FP3CCAGCCAGTCAACCAGCT

北美种猪繁殖

RP1GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTY

与呼吸综合征N基因

RP2GGCTTCTCCGGGCTTTTCT

病（PRRSV-NA）

RP3GGGCTTCTCCGGGTTTTTATTC

Probe1FAM-CGGTCCCTTGCCTCTGGAC-BHQ1

Probe2FAM-CCGGTCCCTTRCCTCTRGACT-BHQ1

FP1CCAGCCAGTCAATCAACTGTG

FP2GCCAGTCAGTCAATCAACTGTG

FP3CCAGCCAGTCAATCAGCTGT

FP4GCCAGTCAGTCAATCAGCTGT

欧洲种猪繁殖RP1TCATCTTCWGCAGCCAGGG

与呼吸综合征N基因RP2TCATCTTCAGCAGCCAAGGG

病（PRRSV-EU）RP3TCATCTTCAGCAGCTAGGGGA

RP4TCATCTTCAGCAGCTAAGGGAAA

RP5TCATCTTCAGCGGCCAGG

Probe1HEX-TGATRAARTCCCAGCGCCAGC-BHQ1

Probe2HEX-ATGATAAGGTCCCAGCGCCAG-BHQ1

FP1CCTGTCACCTCTGACTAAGGG

FP2ATCCTGTCACCTCTGACTAAAGG

FP3ATCTTGTCACCTCTGACTAAGGG

动物A型流感病FP4CCTGTCACCTCTGACCAAGG

M基因

毒（AIV-A）RP1CGTCTACGCTGCAGTCCTC

RP2CGTCTACGCTGWAGTCCTCG

RP3CGTCTACGTTGCAGTCCTCG

ProbeCy5-ACGCTCACCGTGCCSAG-BHQ2

5

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附录C

（资料性）

病毒核酸提取步骤

C.1CarrierRNA溶液的配制

C.1.1CarrierRNA储存液配制

向装有310μgCarrierRNA冻干粉的管子中加入310μLRNase-FreeddH2O，将CarrierRNA彻底溶解，

得到终浓度为1μg/μL的溶液，并分装、置于-20℃储存。

C.1.2CarrierRNA工作液配制

根据样品数量计算所需缓冲液GB和CarrierRNA溶液的体积（计算公式如下1和2），将缓冲液GB

与CarrierRNA溶液颠倒混匀，即得到CarrierRNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋

振荡。

公式（1）

公式（1）中：y为需要加入缓冲液GB的体积（mL）；

n为同时提取的样品个数；

m=0.22mL。

公式（2）

公式（2）中：z为需要加入CarrierRNA溶液的体积（μL）；

y为需要加入缓冲液GB的体积（mL）；

x=28μL/mL。

C.2操作步骤

C.2.1用移液器将20μLProteinaseK加入一个干净的1.5mL离心管中。

C.2.2向离心管中加入200μL血浆/血清/病毒培养液或25mg组织匀浆（样品需平衡至室温），如果

样本体积小于200μL，可加入0.9%NaCl溶液补充。

C.2.3加入200μLCarrierRNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。

C.2.456℃孵育15min，简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。

C.2.5加入250μL无水乙醇，涡旋振荡15sec，彻底混匀，在室温（15℃-25℃）放置5min。

C.2.6简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。

C.2.7将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱放在收集管中），盖

上管盖，6,000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

C.2.8小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管

盖，6,000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。

C.2.9小心打开吸附柱盖子，加入600μL溶液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管

盖，静置2min，6,000×g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。

6

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C.2.10重复步骤2.9。

C.2.11小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，6,000×g离心1min，弃收集管中的

废液。

C.2.12将吸附柱放回收集管中，13,400×g离心3min，使吸附膜完全变干，弃收集管中的废液。

C.2.13将吸附柱放入一个新的RNase-Free离心管（1.5ml）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3

min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加20-150μLRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室

温放置5min。

C.2.1413,400×g离心1min，收集到的即为病毒总核酸（DNA或RNA）。

注：上述提取步骤以TIANampVirusDNA/RNAKit为例，如果使用其他等效核酸提取试剂，请遵照试剂盒使用说明书操

作。

7

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附录D

（资料性）

一步法三重荧光PCR反应体系

一步法三重荧光PCR反应体系见表D.1。

表D.1一步法三重荧光PCR反应体系（20μL）

混合液组分体积（μL）终浓度（nM）

2×MultiplexRT-PCR缓冲液101×

Multiplex酶混合液11×

引物混合物1.6400

PRRSV-NA探针（FAM标记）0.4200

AIV-A探针（Cy5标记）0.4200

PRRSV-EU探针（Hex标记）0.4200

病毒总核酸5

ddH2O补齐至总体积20

注：1.引物混合物指的是3种病原的所有引物；2.此反应体积以Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit为例，如果使

用其他等效试剂，请遵照试剂说明书配制。

_________________________________

8

ICS11.220

CCSB41

团体标准

T/CVMAxxx—xxxx

动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁

殖与呼吸综合征病毒三重荧光RT-PCR

检测方法

TriplexrealtimeRT-PCRdetectionmethodforAnimalinfluenzaAvirus、

NorthAmericanandEuropeanporcinereproductiveandrespiratory

syndromevirus

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重

荧光RT-PCR检测方法

1范围

本文件规定了动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光RT-PCR检测

方法操作规程。

本文件适用于动物A型流感病毒与北美种和欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

AIV-A：动物A型流感病毒（AnimalInfluenzaAVirus）

PRRSV-NA：北美种猪繁殖与呼吸综合征病毒（NorthAmericanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

PRRSV-EU：欧洲种猪繁殖与呼吸综合征病毒（EuropeanPorcineRespiratoryandReproductive

SyndromeVirus）

FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein）

Cy5：荧光发光基团

Hex：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）

BHQ：荧光淬灭基团

5仪器和设备

1

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多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2℃~6℃和-20℃）、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩

涡器、移液器及吸头（至少包括10μL、200μL和1000μL三个量程）。

6试剂和耗材

6.1试剂

6.1.1病毒总核酸提取试剂TIANampVirusDNA/RNAKit或者其他等效核酸提取试剂。

6.1.2Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit或者其他等效多重荧光RT-PCR试剂。

6.1.3无水乙醇（分析纯）和75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和DEPC处理水配制）及实验用

水按照GB/T6682规定使用，-2