干燥叶片与新鲜叶片对DNA提取的影响

一、前言我国的药用植物资源非常丰富，能够在医疗上起到防病、治病功效的植物就可以被称为药用植物。而其用来制药的部分可以是部分植株或者是整棵植株[1]。中国地大物博，有12807种中药资源种类，这其中药用植物就占据了11146种，比例高达87%，它们总共涵盖了383科，2309属。以上数据均由第三次全国中药材资源普查统计得到，这些数据充分体现了药用植物在中药界中的重要地位[2]。虽然我国药用植物种类繁多，但因代用药材和民间药材的接连出现，导致中药材品种混乱、真假难辨，同名异物、同物异名的现象层出不穷。这对于中药产业现代化进程有一定影响。本次研究所选实验材料为一种菊科植物，菊科是被子植物中最大的科，它种类最多，且有较高的药用、经济和观赏价值[3]，这是一种于市面上出售并使用的已知药效的药用植物，但是我们仅仅已知它为菊科，对于其科内属的真实身份却还未确定。而随着医药技术的发展，我国的生药鉴定技术也日渐完善，主要分为传统鉴定技术和分子鉴定技术两大阵营[4]。而这其中有绝对优势的分子鉴定方法是基于DNA条形码的一种鉴定技术，它经过十多年的发展和应用，已被广泛地应用于药用植物的分类鉴定邻域，能够很好的弥补传统鉴定方法的不足。DNA条形码（DNAbarcoding）的概念是由Hebert等[5]于2003年提出的。DNA条形码的技术流程常包括处理样品、提取DNA、PCR扩增、DNA测序、拼接序列、分析鉴定六个环节[6]。由于药用植物种类繁多，在不同组织器官中通常会含有不同的次生代谢产物，如多糖、色素、脂类、酚类等，这些均会对DNA提取质量和产生严重影响，以至于影响到PCR扩增结果。所以从样品DNA中提取到质量较高的DNA对于条形码研究来说是至关重要的步骤和前提[7]。因此不论是为了该植物的身份的鉴定，还是为了其药用价值所做的其他研究，探究出一条适用于该植物的DNA提取、PCR扩增的方法都是非常有实际意义与价值的。所以本实验以求探索出一种用于所选菊科药用植物的切实可行的能够得到DNA片段的方法，为基于此的后续实验做准备和参考。本研究采用三种不同的DNA提取方法，手工研磨法、滤纸纯化法[8]和试剂盒法[9]，并且目标产物为ITS序列，以求探索出更可行且高效的实验方法。ITS序列存在于rRNA基因群中的一个重复单位（rDNA）当中，由ITS1——介于18SrDNA与5.8SrDNA间和ITS2——介于5.8SrDNA与28SrDNA间，这二者组成[10]。具有变异性高，通用性好，扩增和测序料率高等优点，在重楼属、葫声科、豆科、菊科[11]、裸子植物、藻类、真菌和高等植物等药用生物的鉴定中综合评价指标最优。而衡量本次实验是否成功的标准是能否在扩增后的琼脂糖凝胶电泳图上得到单一清晰的条带。33二、材料与方法32.1实验材料3实验材料来自于丽江老君山25000米附近海拔的采样植株。选取植株叶片做为材料,将采集的叶片放入标记好的的封口袋中并尽早带回实验室放入硅胶中干燥处理。2.2实验方法2.2.1样品DNA提取方法本次实验采用三种不同的DNA提取方法，分别为手工研磨法、滤纸纯化法、试剂盒法.2.2.1.1手工研磨法实验试剂：裂解液，萃取液(氯仿：异戊醇=24：1)，巯基乙醇，异丙醇，PVP，石英砂，70%乙醇，无水乙醇。具体操作步骤如下：首先将所用叶片用手术剪剪成小块，取一个完全干燥且重量不变的成扁形的称量瓶，将剪后的叶片平铺其中。然后在60℃的烘箱中，开启瓶盖干燥5个小时后，在干燥器中盖好瓶盖冷却30min后，再进行精确的称量。之后又放置在60℃的条件下再次干燥3个小时，静置待它冷却后称取其重量，多次称量直到其重量前后两次的质量差不超过2mg为止。添加石英砂、PVP、200µL裂解液，一起研磨至粉末样后再加入500µL裂解液，总量不超700µL。水浴2~3.5h。取出静置常温，加700µL萃取液，轻轻反复倒置5次混匀，静置1min后离心12000rpm10min。准备新的离心管加入300µL萃取液，取离心好的上清液500~600µL，加入其中。再离心12000rpm10min。准备新的离心管加入350µL异丙醇，取全部离心好的上清液，加入其中，切记不可取到下层液体。沉降过夜。解冻3min，离心12000rpm10min。留沉淀，倒扣吸水纸上，沥干。加入70%乙醇400µL，轻轻反复吹打，至沉淀溶解不见。离心12000rpm4min。留沉淀，倒扣吸水纸上，沥干。加入无水乙醇400µL，轻轻反复吹打，至沉淀溶解不见。4离心12000rpm4min。4留沉淀，倒扣吸水纸上，沥干，自然干燥20min以上至出现白色积块(去除乙醇)。成样保存。加入50µLddH2O，-20℃冰箱保存。2.2.1.2滤纸纯化法这是一种新型且快速的提取中药材DNA的方法，基本原理是利用含有较多纤维素的试纸如WhatmanNO.1等，从无论是植物、动物还是微生物中在30s内实现核酸的提取以及纯化，操作十分简便，不需其他任何实验仪器。这种方法起初是由Zou等[12]报道的，且已经证实其有良好的普适性，对于不同部位的植物药材DNA提取和分子检测均适用[8]。滤纸条制备：首先用剪刀裁剪滤纸成44mm×2mm的长方形，将此滤纸条的一端约40mm×2mm浸入加热融化的石蜡中，等待其晾干后形成疏水手柄区域，以便手动转移，前端未浸入石蜡的部位就是核酸结合区。植物药材裂解液配方：2.5mmol/LEDTA、25mmol/LNaCl、20mmol/LTris(pH8.0)、0.05%SDS。操作步骤：将新鲜或干燥药材经液氮研磨成粉末后取0.05～0.20g，放入2mL离心管中,并加入500μL裂解液裂解样品7s；将准备的滤纸条的前端核酸结合区浸入，等待3s以吸附核酸；之后把滤纸条放进1750μL清洗液中，停留3s来清洗吸附在表面的杂质；之后将滤纸条转移至已配制完成的扩增反应体系中，等待3s以洗脱表面吸附的核酸。2.2.1.3试剂盒法采用Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒。55试剂盒内容物：RNaseA，β-疏基乙醇，溶液A，溶液B，溶液C，漂洗液，洗脱液，吸附柱，收集管。使用前先参照瓶体上标签的要求将无水乙醇添加至漂洗液当中。还因准备好台式离心机离心，因为所有的需要离心的操作都将使用此器械在室温下进行。具体操作步骤如下：植物组织预处理：于液氨中将干重组织（不超过20mg）或新鲜植物组织（不超过100mg）尽可能的研磨到该组织呈现细细的粉末样，残留的液氮等待它自然挥发即可。将盛有溶液A400µL、RNaseA(10mg/mL)20µL和B-疏基乙醇5µL的离心管提前准备好，在上一步研磨结束后就快速的将得到的粉末移至其中，再多次颠倒混匀，在室温下等待10min即可。加入溶液B140µL，颠倒混匀，于12000rpm离心10min，之后将上层清液转移至新离心管（约400-500µL），注意操作时不要将沉淀吸入。在上清液中加入同等体积的溶液C，多次颠倒混匀后，再将与溶液C同等体积的无水乙醇加入其中，这时若有絮状产物出现在溶液中，只要将絮状物打散，接着一起添加进吸附柱中即可，后于12000rpm离心5min，弃废液。若一次不可完全加入的话可以分为两次。注意：若吸附柱膜显示绿色或离心时有堵塞现象，可将600µL无水乙醇添加到吸附柱中，并将离心时间适度延长。将600µL漂洗液加入到吸附柱中（请先确认无水乙醇是否已加入）。再于12000rpm离心1min，弃去废液，将收集管放回到吸附柱中。加入600µL漂洗液于附柱中，于12000rpm离心1min，弃去废液，把吸附柱放回到收集管，再于上述转速和时间离心一次。在室温或50℃温箱中将吸附柱放置数分钟，为了防止接下来的实验例如酶切和PCR等被残余的乙醇影响。在一个洁净的离心管中放置吸附柱，将洗脱液在65℃水浴预热后，悬空向吸附膜的中间滴加50-200µL，室温下放置1-5min后，于12000rpm离心2min，便获得了质量较好的DNA。(可选)向吸附柱中放入上一步离心之后的洗脱液，静置于室温中等待2min，再于12000rpm离心2min。2.2.2DNA纯度和浓度检测6取少量提取纯化后TE溶解的DNA溶液，使用紫外分光光度计测定OD260/OD280和OD260/OD230的比值，并据此判断DNA纯度、有无杂质，当1.8≤OD260/OD280<2.0时，说明DNA纯度较高，蛋白质、RNA，酚类物质等的污染较少。当OD260/OD230≥2时，DNA纯度较高，有机溶剂、多糖、盐类等的污染较少。6根据OD260值，DNA浓度可通过公式：DNA浓度(μg·mL-1)=OD260×50×稀释倍数/1000来计算。2.2.3PCR扩增扩增ITS序列所用引物[13]：正向为5'-ATGCGATACTTGTGTGAAT-3',反向为5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR反应体系[14]：MgCl2（25mM）2µLdNTP（2.5mM）2µL10×buffer2.5µL引物上游（2.5µM）1.0µL引物下游（2.5µM）1.0µLTaq酶（1U/µL）1µL总DNA（约30ng/µL）1µL加入ddH2O使反应体积达到25µL扩增程序[15]:预变性5min96℃30个循环变性30s94℃退火45s52℃延伸45s72℃最终延伸10min72℃在此过程中改变退火温度分别为48℃，52℃，55℃，57℃，以探究该反应的最适退火温度。2.2.4电泳检测扩增反应完成后将所得PCR产物取3μL与1μL的6×LoadingBufferDNA混合均匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。三、结果与分析3.1DNA纯度和浓度检测结果7由表1所示，试剂盒法提取到的DNA质量最好，OD260/OD280在1.8~2.0范围内，OD260/OD230﹥2，这表示该DNA的纯度是比较高的[16]，并且RNA、蛋白质、盐类、有机溶剂等杂质的污染较少，只是DNA浓度明显低于另外2种方法。滤纸条法提取的DNA质量较好，其DNA浓度较高，OD260/OD280在1.8~2.0范围内，OD260/OD230略低于2.0，说明DNA纯度比较好，但存在少量盐类或有机溶剂等其他杂质污染。手工研磨法提取到的DNA的浓度相较于其他两种方法是最高的，但DNA质量稍差，OD260/OD280值小于1.8，OD260/OD230低于2.0，表示DNA虽然纯度较好，但存在RNA、蛋白质、盐类、有机溶剂等杂质的污染现象。然而我们发现如果将萃取剂氯仿:异戊醇(24:1)改善为苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，就能有效提高核酸提取效率，能使OD260/OD280值达到1.8~2.0范围内。这是因为苯酚在一定程度上能够使蛋白质变性，达到有效去除蛋白质的效果。7表13种方法提取基因组DNA质量及浓度检测方法OD260/OD280OD260/OD230DNA/(mg/L)手工研磨法1.711.72477.4滤纸条法1.821.93393.6试剂盒法1.892.16159.83.2DNA提取时取料量的影响对于DNA提取时取料量的探究，我们发现三种方法均有其适宜的取量范围，如滤纸法为0.05～0.20g，试剂盒法为新鲜植物组织≤100mg、干重组织≤20mg，手工提取法为≤0.20g，在该范围内均可扩增成功，若高于此范围则会使裂解液变得黏稠甚至成糊状，这会对后续操作产生不利影响。下图是滤纸法不同取料量的电泳结果（图1）。图1电泳图3.3干燥叶片与新鲜叶片对DNA提取的影响8我们在DNA提取过程中发现，干燥叶片对于实验的进行较新鲜叶片要好些，因为首先在研磨的时候干燥叶片要比新鲜叶片容易些；其次新鲜叶片在研磨结束后后续操作不及时容易引起褐化，添加含有β－巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的提取液可防止[17]，而干燥叶片在研磨后也不易褐化；再者新鲜叶片经冰箱冷冻后取出会出现水渍状，产生冻伤现象，而干燥叶片则不会产生此现象。但由于中药材本身就多为干品，它的DNA会逐渐降解的愈发严重并且有较多的次生代谢产物生成，从此方面讲干品会比新鲜样品更加难以提取[18]。对此我们经过文献查询尝试了硅胶干燥处理样品。我们使用紫外分光光度计法检测用硅胶干燥处理[19]过的叶片样品中提取的DNA，结果表明其D260nm/D280nm的值为1.80~1.90，这与从新鲜叶片样品中提取到的DNA无明显差异，因此表明叶片在干燥处理后置于不同温度下（25℃，-20℃，－80℃）短期保存（3个月），DNA质量也无明显差异[20-21]。83.4PCR扩增检测不同DNA提取方法的提取质量为了考察不同的提取DNA的方法对于扩增结果的影响，我们对手动研磨法，滤纸条法和试剂盒法三种方式所得DNA进行了PCR效果的对比。由图2可看出，对采用滤纸条法和试剂盒法提取到的DNA作为模板，经过PCR扩增反应获得的条带不仅清晰并且亮度也较高，稳定性好，而手工研磨法提取的DNA作为模板经过PCR扩增反应获得的条带在亮度和清晰度上稍差，稳定性有所降低。虽然手工研磨法得到的结果稍差于另外两种方法，但其实也能获得满足部分后续实验要求的理想的条带。图2电泳图3.5退火温度对PCR扩增产物的影响9我们在实验中设计了四个不同的退火温度，在这四个温度下对ITS序列进行PCR扩增，然后对其产物经琼脂糖凝胶进行电泳检测，我们发现条带的大小和亮度都存在差异（图3）。其中当退火温度为48℃时，所得3个PCR产物条带都非常亮，但会出现明显的弥散拖尾现象。这是由于低温使扩增的特异性降低，使扩增产物不仅仅是目的PCR产物，还有一些杂带的出现。这会影响后续试验，会给纯化和测序带来困难。当退火温度是57℃时，所得产物条带的亮度稍微弱一些，且形状较小，说明此退火温度不能有效扩增出足够的PCR产物。而在退火温度为52℃和55℃时条带较明亮，其中，温度为52℃时得到的带型最好，粗细适中且明亮，没有杂带。说明ITS序列在退火温度为52～55℃时扩增出的PCR产物出质量较高，其中最佳退火温度应为52℃。9图3电泳图四、讨论分子生药学研究的首要环节是核酸提取。所以快速有效地进行核酸提取以及核酸扩增是接下来的分子检测的必要条件。DNA提取和PCR扩增步骤对于不同类别的物种很可能是不同的，而本次试验则在前人的基础上成功的探讨出了一条适用于所选菊科药用植物的方法。其中对于DNA提取来说主要是分析用不同的方法来提取DNA间的优与劣，不同实验目的对DNA质量的要求不同，对于普通PCR检测，含有杂质较多的DNA也能达到实验目的。然而，一些高灵敏度的分子生物学实验(例如以酶切为基础的实验及分子标记分析实验等)对于DNA的质量要求就会比较高[22]。而本次实验选择了三种非常具有代表性的且各有其优势的提取方法进行对比，分别是手工研磨法、滤纸纯化法和试剂盒法。其中手工研磨法操作较为繁琐，得到的DNA质量稍差，可用于一般的PCR反应，仅能满足一些简单的分子生物学实验要求。而对于试剂盒法来说，虽然它能够得到质量较高的DNA，但它的成本相较于其他提取方法来说比较高，而且这种方法每次提取到的DNA量往往较少，因此不适于需提取大量DNA的实验。最后综合各种利弊考虑发现，滤纸纯化法作为一种新生代的简易方法是非常优秀的，是非常值得推广和使用的。该方法可以在30s内成功提取到植物的DNA，且纯度较好，能取得与其他常用DNA提取方法差不多甚至优于某些方法的扩增结果，并且对于取料量的多少没有严格要求。该提取方法还无需任何设备，只需用普通定性滤纸制作一个滤纸条外加两个分别装有裂解液和清洗液的EP管即可，极大的降低了提取成本。而且它操作简便，不易受污染，更易制作成试剂盒应用于快检邻域，在未来