肝豆状核变性基因治疗研究进展2026

肝豆状核变性基因治疗研究进展2026肝豆状核变性（Wilsondisease，WD）属于常染色体隐性遗传病，其致病机制是ATP7B基因的致病性变异引起铜代谢障碍。在这个过程中，铜会在肝脏、脑等组织中异常蓄积，引起多个系统损伤［1］。WD早期多表现为肝脏受累，疾病进展后可出现神经和精神等症状，最终约有44%的患者死于肝硬化或肝衰竭，还有部分患者会死于败血症及其他并发症［1］。一项队列研究对比发现WD患者10年内病死率约为普通人群的4倍。基因筛查的数据也提示存在潜在的一定数量的未诊断病例，这进一步凸显了WD作为一种“并不罕见”的罕见病的重要公共卫生意义［2］。迄今为止，国际数据库收录的ATP7B基因变异约有1600种，其中致病性变异约600种，其中c.3207C>A（p.H1069Q）为全球最常见的致病变异类型［3］。在我国患病人群中，c.2333G>T（p.R778L）和c.2975C>T（p.P992L）位点的变异较为常见［4］。WD的传统治疗方式包括控制饮食、拮抗铜摄入（如锌剂）和促进铜的排出（如青霉胺）。但是这些治疗往往需要终身服药，而且大多可能伴随较多不良反应，无法从根本上纠正基因缺陷，最终部分患者依然进展为终末期肝病或出现神经损害问题［5］。近年来，基因替代、基因编辑及RNA调控等新兴基因治疗方法显示出潜力，为根治该病提供了新的可能性［6］。1

基因替代策略基因替代策略主要通过向肝细胞递送功能性ATP7B基因以补偿内源性基因缺陷。由于WD为常染色体隐性遗传病且无单倍剂量不足效应，在杂合子携带者中仅需约50%的ATP7B表达量即可维持正常铜代谢。动物研究亦表明恢复10%~20%的肝细胞ATP7B活性即可重建铜稳态，这一低阈值特性使WD被认为是最适合进行基因替代治疗的单基因肝病之一［7］。1.1

载体容量限制与基因截短设计基因递送载体的种类丰富，包括慢病毒载体、腺病毒载体、脂质载体、外泌体载体，而病毒载体目前最常用［8］。腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）具有安全性高、免疫原性低、能高效转导非分裂肝细胞的优势，因此已成为目前最成熟、最常用的基因递送平台［9］。已有研究用AAV8载体递送全长ATP7BcDNA，在Atp7b-/-小鼠中实现了长期代谢纠正，铜蓝蛋白水平恢复正常，症状明显改善，由此有力地证明了WD基因治疗的可行性［10］。但现有AAV包装容量约4.7kb，而全长ATP7B表达框（cDNA）本身已占约4.4kb，若再添加启动子等调控元件，极易发生基因截断或病毒滴度下降［11］。为突破这一挑战，已经有了初步的研究尝试。目前已有证据表明ATP7B蛋白N端的金属结合域（metal-bindingdomains，MBD）中前四个结构域（MBD1~4）主要是发挥调节功能而不是转运所必需，因此设计的截短型ATP7B既很好地适配AAV容量，又提高了滴度，在多种模型中都证明其能正确定位、长期稳定地执行排铜功能，故被公认为临床转化的首选方案［12］。更为重要的是，近年来已有若干类似的截短策略在另一WD模型中得到了充分的验证：单次注射后的疗效可持续52周，直接、充分地证实了截短型ATP7B在重建胆汁排铜及维持长期铜稳态方面的可靠性［13］。近期国内研究者又利用类似的ΔC4ATP7B截短体，在突变小鼠模型中对该方案的安全性及疗效做了较为严谨的再验证［14］。因此，这类截短型设计在克服载体容量限制的同时有效保留了必要功能，已成为目前WD基因治疗较明确、较成熟的方向。1.2

基于双载体系统的全长基因递送尽管截短型设计有效，但在高铜和精细调节上全长蛋白更有优势。通过双载体系统的转染，研究者应用分裂内含肽介导的蛋白反式剪接使截短蛋白在细胞内重组为全长蛋白。但该策略由于双载体共转导效率较低以及生产质量控制困难，因此目前处于临床前优化阶段［15］。1.3

基因替代策略临床转化与疗效评估UX701（NCT04884815）的临床中期数据表明，停用标准治疗之后，受试者体内非铜蓝蛋白结合铜仍维持正常水平，铜蓝蛋白氧化酶活性明显提高。这进一步证明，转入的ATP7B不仅促进胆汁排铜，还在一定程度上恢复了铜蓝蛋白的生物合成功能。因此该疗法耐受性良好，但仍需要合理设计免疫抑制方案来控制AAV衣壳引发的免疫反应。VTX-801（NCT04537377）的研究中，研究者采用放射性铜（⁶⁴Cu）PET成像技术来评价药效。欧洲肝脏研究学会所发表的结果明确地表明治疗后肝脏⁶⁴Cu滞留明显减少，组织学指标改善，铜蓝蛋白活性升高，因此也为截短型ATP7B蛋白在人体中的有效性提供了直接证据。国内基因治疗领域已经有重大进展。新型药物GC310腺病毒相关注射液于2025年获得临床试验默示许可，同年又获美国FDA的孤儿药资格认定。该药现已进入多中心Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段，标志着国产WD基因疗法进入临床实证阶段。与此形成良好补充的是另一款WD基因治疗候选药物LY-M003，其从设计之初就高度重视安全性，采用铜离子响应性动态调节系统，能根据肝细胞内铜离子浓度动态精确地调节ATP7B表达水平，所采用的“按需治疗”策略有利于降低蛋白过表达的各种风险。目前该药物也处在临床试验阶段。2

基因编辑策略与基因替代疗法不同，基因编辑技术旨在原位修复内源性致病突变，这对于仍处于生长发育期的患儿具有较大优势。修复后的基因组可随肝细胞分裂稳定遗传，有效解决了非整合型AAV载体随细胞增殖稀释所导致的“长效性丢失”问题［16］。2.1

CRISPR/Cas9介导的同源重组修复CRISPR/Cas9系统利用单链寡核苷酸（single-strandedoligodeoxynucleotides，ssODN）作为供体模板和同源重组修复（homology-directedrepair，HDR）机制在体内精准纠正突变［17］。研究者利用WD细胞铜毒性的病理特征建立“功能性筛选”模型。研究者在培养基中加入一定浓度的铜离子作为选择压力，成功筛选出能够完成编辑、具有Cas9剪切位点和碱基互换模板所在附近区域发生功能变化的细胞。这样编辑成功的细胞就具备了这种特定的功能性表型以及在这一特定条件下的生存优势，进而实现了编辑效率的大幅提升（约60%）。研究证明，铜毒性筛选有助于编辑体系进一步的优化［18］。有研究使用诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSC）技术，将WD患者体细胞重编程为诱导性肝细胞样细胞（inducedhepatocyte-likecells，iHeps），继而用CRISPR/Cas9联合ssODN修复突变，使ATP7B蛋白重新定位于反式高尔基体网络，进而恢复铜转运功能［19］。更重要的是，修复后的iHeps被脾内移植入免疫缺陷WD小鼠体内，能归巢于肝脏并定植，由此降低肝铜蓄积并改善纤维化［20］。然而，HDR策略在体内转化仍面临挑战。成年肝细胞多处于静止期（G0

期），而HDR只在分裂活跃的S/G2

期起作用，故HDR效率受到影响，非同源末端连接导致的随机插入缺失更易发生［21］。更重要的是，DSB诱发的基因毒性，诸如染色体易位、p53介导的细胞凋亡，都是重大的安全隐患［16］。因此目前的CRISPR/Cas9-HDR技术更适宜作为体外细胞疗法的工具，不宜体内直接给药。2.2

碱基编辑（baseediting,BE）及先导编辑（primeediting，PE）的应用潜力BE及PE都具有规避DNA双链断裂，从而避免相关脱靶效应的明确优势。目前BE主要可分为胞嘧啶碱基编辑器（cytosinebaseeditor，CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（adeninebaseeditor，ABE），分别介导C>T和A>G的碱基转换［22］。但值得注意的是，我国患者人群中高发的R778L（c.2333G>T）突变属于G>T颠换，而传统BE的检测范围仅覆盖转换，不能直接检测颠换，故从原理上就限制了其对该类致病突变的检测应用。虽然近年已有通过工程化改造Cas蛋白来扩展原间隔序列邻近基序检测范围的尝试，但传统BE仍难高效地引入颠换突变，因此其在特定致病突变修复中的应用仍受较大限制［23］。相较于受突变类型限制的BE，PE在理论上能够实现全部碱基替换，并支持小片段插入/缺失，被认为更适合WD这类突变谱高度异质疾病的检测。PE系统由Cas9H840A切口酶融合逆转录酶构成的效应蛋白及向导RNA（primeeditingguideRNA，pegRNA）组成。pegRNA3′端携带逆转录模板，引导切口酶在靶位点产生单链切口，并以“搜索与替换”的方式将正确序列写入基因组，实现低基因毒性风险下的精准校正［24］。在研究H1069Q突变时，研究者发现使用脂质纳米颗粒（lipidnanoparticles，LNP）递送的PE系统在人源化小鼠模型上实现了约80%的修复率和较强的降肝铜效果。在非人灵长类模型上单次给药即可获得约51%的精确编辑效率，因此PE或许可以成为治疗WD复杂突变的有效工具。2.3

选择优势的无启动子靶向整合有研究利用WD患者肝脏在高铜环境下的选择性生存优势，采用不含启动子的AAV载体递送ATP7BcDNA序列，并将治疗基因整合于高表达白蛋白的位点。虽然初始整合率较低（<1%），但是研究证实选择优势的无启动子靶向整合能在避免脱靶风险的同时获得长期、可靠的治疗效益［16］。3

RNA

调控策略和DNA层面永久修饰不同，RNA疗法是在转录后或者翻译层面调节ATP7B表达量。RNA调控疗法能够实现可逆性调整，并且可按照需求进行剂量调节，没有插入突变问题，不会影响基因组完整性，其发挥疗效的时间周期较短，也更容易控制药品的用量［25］。3.1

LNP介导的mRNA替代该策略采用LNP将全长人源ATP7BmRNA递送至肝脏，细胞内表达后即可直接翻译成有功能的蛋白，因而能高效、快速地恢复胆汁排铜能力［25］。更重要的是，临床前研究已经确凿地证明单次给药即可显著改善小鼠胆汁铜排泄及血清学指标。mRNA半衰期很短，故需要重复给药，但是正因如此，该方法天然地避开了病毒载体的免疫原性及基因组插入风险，因此是急性肝功能衰竭或失代偿期快速“去铜”干预的理想选择［25］。目前，候选药物DSL101（NCT07240896）的临床试验已经正式启动，标志着该策略正式迈入临床阶段。3.2

反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides，ASO）介导的剪接干预由于ASO介导的剪接干预直接针对由深层内含子突变所致的异常剪接，故ASO本身即为一种不需要改变基因组的高精准的治疗手段［26］。更重要的是，研究者利用计算生物学算法识别剪接调控位点，之后，采用剪接转换型ASO（例如DG12P1）特异性结合前体mRNA，掩盖异常剪接位点，促使正确外显子保留，由此自然、高效地重建全长功能性ATP7B表达［26］。又因ASO分子量小、生产成熟、肝脏摄取率高，故其被视为治疗特定基因型个体的理想新方向［27］。4

转化障碍与展望虽然目前WD基因治疗已有长足的进展，但要使其真正应用于临床，就必须先解决免疫耐受、长期疗效维持、疗效评价标准化等问题。4.1

免疫屏障与再给药难题AAV诱导的免疫应答是限制治疗可及性与持久性的最突出、最根本障碍。从体液免疫的角度上看，流行病学数据表明，30%~60%的成年人群中对AAV2、AAV8等常见血清型存在预存中和抗体，因此其直接阻断病毒进入肝细胞，故相当比例的患者不符合入组研究的条件［28］。从细胞免疫的角度上看，进入肝细胞的AAV衣壳蛋白经过加工并呈递至MHCⅠ类分子后，可激活细胞毒性T细胞，导致转导的肝细胞被靶向清除，临床表现为转氨酶升高、疗效骤降［29］。目前临床常用皮质类固醇或雷帕霉素等进行免疫抑制，但开发低免疫原性新型衣壳或特异性免疫耐受诱导策略才是未来的明确方向。4.2

长期儿科应用的限制AAV基因组主要是以游离体形式存在于细胞核内，不整合于宿主染色体，而WD最常见于儿童及青少年，此时其肝脏处于快速生长、高度代谢活跃的阶段，随着肝细胞的不断分裂增殖，非整合的AAV基因组会被逐渐稀释甚至丢失［16］。因此，单纯使用AAV基因替代疗法治疗儿童患者时，有明确的“疗效衰减”风险。针对这一人群，实现基因组定点整合的基因编辑技术是研究热点，可重复给药的LNP-mRNA疗法在理论上更具优势。4.3

疗效评价标准的重构基因治疗后疗效评价标准的确立有重要临床意义。目前对“治愈”的定义还没有统一标准，而传统血清铜蓝蛋白水平受炎症等多种因素干扰，故已不再适宜作为主要终点。肝活检虽然准确，但侵入性手段不宜频繁采样，故其监测病情的临床价值有限。因此，近年来临床试验中所采用的评价体系更倾向使用直接、可靠反映铜毒性的功能性指标。非铜蓝蛋白结合铜及可交换铜被公认为反映游离铜毒性更为敏感的指