第七章DNA体外重组与基因转移总结

第七章DNA体外重组与基因转移二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）一、DNA的体外重组（切、接）第八章重组子的筛选与鉴定（检）

第九章外源基因的表达

切接转增检一、DNA的体外重组（切与接）1.同种内切酶生产的粘性末端的连接2.同尾酶生产的粘性末端的连接3.不同粘性末端的连接5.粘性末端的更换4.人工粘性末端的连接6.重组率1.同种内切酶生产的粘性末端的连接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG2.同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BclIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT3.不同粘性末端的连接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC4.人工粘性末端的连接（1）5′突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHI4.人工粘性末端的连接（2）3′突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI4.人工粘性末端的连接（3）平头末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT5.粘性末端的更换BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinkerBamHI的位点已被破坏6.重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。进行体外重组(体外的连接反应)注重的插入片段和载体的比值。重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶特别针对单酶切连接重组率提高重组率的方法加装同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增）1.转化的原理与技术2.转化率3.转化细胞的扩增1.转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态.

①感受态细胞的制备（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化感受态的制备：菌液接种于LB液体培养基中，37℃至OD=0.3～0.4；收集菌体；预冷的CaCl2

溶液重悬细胞，冰上放置30min；再次收集菌体；预冷的CaCl2溶液悬浮细胞。（若现用，可4℃保存，12～24h内使用转化效率最高；若长期使用，加灭菌的甘油至终浓度为15%～20%，混匀，液氮速冻后冻存于-70℃冰箱中。）②重组质粒的转化感受态细胞大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng

载体的重组冰浴静置30min；在42℃静置

90秒（热激）；快速将转化细胞转移至冰浴中静置2

min；

DNA连接液，轻轻混匀；加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1h（恢复活力、扩增并表达抗性）；

涂在含抗生素的固体培养基平板上进行蓝白斑筛选（2）细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子

酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化

不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂

①细菌原生质体的制备：取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20mlDNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀

②细菌原生质体的转化：细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素

（3）l噬菌体DNA的转染①感受态细胞的培养：

将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5②吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟③转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选（4）电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验2.转化率（1）转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA

（2）转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，

经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个

重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？

若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：

104/107

X10-2=0.1mg载体DNA

考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：

0.1/20%=0.5

mg载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选

（3）转化率的影响因素①载体及DNA重组分子方面：

载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同

载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低②受体细胞方面：

受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高

③转化方法方面：

受体细胞的预处理：影响最大供受体的比例：Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA

转化方法：Ca2+诱导转化106-107/mgDNA

原生质体转化109

个原生质体 50ngDNA

原生质体转化105-106/mgDNA

l-DNA转染107-108/mgDNA

电穿孔转化106-109/mgDNA

3.转化细胞的扩增（1）扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：

Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程

l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作

（2）扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定第八章重组转化子的筛选和鉴定（检）一、载体遗传标记检测二、克隆DNA序列检测三、外源基因产物检测由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子一、载体遗传标记检测1.抗药性筛选法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗药性筛选法的基本原理：

pBR3224363bpori抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在PstI位点：

非重组子呈Apr、Tcr

Tet重组子呈Aps、Tcr

将外源DNA片段插在BamHI位点：

非重组子呈Apr、Tcr

重组子呈Apr、Tcs

环丝氨酸四环素抑菌抗药性筛选法的基本操作：

先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为

ApAp+Tc影印挑选重组子

2.营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理：

营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

氨基酸核苷酸常见的营养缺陷型筛选标记：

哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：

用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型dCDPdTDPdTTP胸腺嘧啶核苷dTMPdTDPdTTPAPTKAP氨基喋呤TK胸腺嘧啶核苷激酶3.显色筛选法显色筛选法的基本原理：

显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等

互补现象（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段受体COOH片段供体lacZ显色筛选法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落

二、克隆DNA序列检测1.限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。某一细菌质粒载体的Tetr基因中含有一个HindⅢ切点，用HindⅢ切割果蝇的基因组DNA，并以该载体构建基因文库，分子杂交证明阳性克隆带有果蝇的目的基因，用HindⅢ和EcoRV对质粒和阳性克隆(克隆15)进行酶切分析，电泳结果如图1，试绘出含有插入片段和不含插入片段的质粒限制性酶切图谱，并标明Tetr的位置。全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriBBEP4.0kb1.0kb0.8kb区分重组子与非重组子用BamHI酶切转化子质粒DNA电泳观察酶解产物片段重组子：2.7kb+4.0kb非重组子：2.7kb如果外源DNA片段也是2.7kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然后通过其长度来鉴定其是否为重组子全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriSSBP4.0kb1.0kb0.8kb区分重组子与非重组子如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的。SphI：150U，120元HindIII：3000U，120元EcoRI：4000U，120元全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriBamHIBamHIEcoRIPstI4.0kb1.0kb0.8kb区分目的重组子与非目的重组子用EcoRI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.0kb+3.7kb或者：1.0kb+5.7kb反向用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子：3.2kb+3.5kb或者：0.8kb+5.9kb反向全酶解图谱法：pUC182.7kbHindIII

SphI

PstI

SalI

BamHI

SmaI

KpnI

EcoRIAprlacZ’oriBBE4.0kb2.0kb2.0kb区分目的重组子与非目的重组子对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0kb和2.7kb两条带子，实际上2.0kb的条带中含有两种不同的分子。2.7kb2.0kbE检测克隆DNA序列的其它方法：菌落或噬菌斑原位杂交法DNA序列分析法蛋白质生物功能测定法掌握：使用噬菌斑原位杂交法检测克隆DNA序列的方法中，杂交探针标记的方法有哪几种？菌落或噬菌斑原位杂交法菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。

菌落原位杂交法的基本操作：影印用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板

洗涤杂交感光用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜

用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜

80℃烘干固定影印薄膜

薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜

用X光胶片覆盖薄膜感光

杂交探针的制备：用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）

足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区

探针的制备方法或来源包括：人工合成cDNA合成

同源序列mRNA

杂交探针的标记1：T4-PNP介导的末端标记5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘杂交探针的标记2：逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’mRNA反转录酶Mg2+

dNTP+pppdATP（a-32P-dATP）5’TTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAACCAGCTTCC···GAACTGATTTAGGCT5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG···CTTGACTAAATCCGA杂交探针的标记3：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP

5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolI杂交探针的标记4：ABC荧光标记GCTTGAGCAGTAACCTG荧光胺Biotin生物素Avidin生物素结合蛋白烷烃连接臂杂交探针的标记5：ABC显色酶标记GCTTGAGCAGTAACCTG显色酶Biotin生物素Avidin

生物素结合蛋白烷烃连接臂生色底物颜色产物杂交探针的标记6：地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗体-显色酶交联复合物DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理：

DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有：DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600bp/601bp）电脑自动检测、记录、编辑程序用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）F.Sanger克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：

A

C

G

T

ssDNA

ssDNA

ssDNA

ssDNA

Primer

Primer

Primer

Primer

KlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA

G

T

C

DNA聚合反应聚丙烯酰胺凝胶电泳克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：

KlenowOH3'5'PTdNTP+

ddATP

TTTTTOH3'5'PA

G

T

C

GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA外源基因产物检测聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法淀粉酶目的基因的鉴定：

淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：

抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：

目的重组子

诱导抗性

抽取重组质粒再次转化外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法DNA结合蛋白编码基因的鉴定：

影印用聚乙烯薄膜影印裂解平板

洗涤杂交感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定

80℃烘干固定影印薄膜

与探针溶液中杂交洗涤、干燥、感光

用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板

聚乙烯膜探针选用能与

目标蛋白特异

性结合的DNA片段

外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法杂交释放转译鉴定：

合并

变性

挂柱

制备

上样

淋洗

洗脱

翻译

测活

重组DNA

单链DNA

mRNA

杂交的mDNA

蛋白质

蛋白质

无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物

外源基因产物检测蛋白质生物功能鉴定法放射免疫原位杂交鉴定：

影印用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印洗涤与I125标记的IgG保温感光轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定

与I125标记的IgG保温洗涤、干燥、感光

用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板

含抗体的聚乙烯膜裂解平板

外源基因产物检测蛋白质生物功能鉴定法免疫沉淀鉴定：

在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体

然后涂布转化液

37℃培养

经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标

蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑

此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大

第九章外源基因的表达

一.当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素：

1.外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体）

2.对转录产物能否进行加工修饰（利用cDNA）

3.转录产物的稳定性

4.转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术）

5.密码子的使用频率（选用适当宿主细胞）

6.翻译产物的后修饰选用适当宿主细胞

7.翻译产物的稳定性

8.外源基因产物对宿主是否有害

9.外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体）

10.外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞）

11.外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体）

12.对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法

二.

表达系统

1.

大肠杆菌系统:

融合表达和直接表达小于80AAs的多肽可用融合表达系统,分子量在100-300AAs且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达

pET(plasmidforexpressionbyT7RNApolymerase),

pTrcHis系列载体

2.

酵母表达系统:

酿酒酵母和巴氏毕赤酵母(Pichia

pastoris)系统

直接表达和分泌表达

3.

昆虫杆状病毒表达系统

直接表达和分泌表达

4.

哺乳动物细胞表达系统

瞬时表达和稳定表达:非微生物来源的大于500AAs的分泌蛋白质和表面受体蛋白考试题型一、名词解释（3’

×

5）二、判断（1’×10）三、填空题（1’×

10）四、问答（10’×

5）五、分析和计算（15’×1;10’×1）

研究基因表达应从以下几个方面考虑：

1）转录：起始，延长和终止。基因转录的调控主要是起始阶段

2）转录后修饰：hnRNA

的加帽，加尾，拼接

3）翻译：起始，延长和终止。调控亦是在起始阶段

4）翻译后修饰：蛋白质的糖基化，蛋白质水解反应，蛋白质的分泌等。一．转录系统

1.体外转录系统

1）分离RNA聚合酶，然后在体外进行待测DNA的转录反应

2）利用全细胞抽提液，加入外源DNA，目前使用最广泛的抽提液来自海拉细胞和KB细胞

3）利用具有SP6,T3和T7启动子的载体转录插入的外源DNA2.

体内转录系统

先分离细胞核，再进行转录反应二．翻译系统体外翻译系统（Invitrotranslationsystem）又称之为体外蛋白质合成系统(invitroproteinsynthesissystem)，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDS—PAGE后可检测出翻译活性。

常用翻译系统有以下几种：

1.兔网织细胞裂解物(reticylocyte

lysatesystem)

由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯肼后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。

2.

小麦胚抽提物(wheatgermextract)

该系统不具内源mRNA，属外源mRNA依赖型，利用Sephadex-G50可减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的mRNA，该系统仅为前一系统活性的1/10。

3.

其它系统：

鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。

4.

两栖动物卵母细胞:

翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏度高（10ngmRNA），也可作为转录—翻译系统。微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的tRNA和rRNA

损伤过