DB34-T 4625-2023 石榴脱毒苗木繁育技术规程

ICS65.020.20CCSB6134Technicalregulationsforvirus-eliminatedtissuecultureseedlingpropagationofpomegranateDB34/T4625—2023I本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽中以农业科技有限公司提出。本文件由安徽省林业局归口。本文件起草单位：安徽中以农业科技有限公司、安徽科技学院、安徽省中以智农众创空间有限公司、安徽省红玛瑙石榴科技有限公司、安徽省质量和标准化研究院。本文件主要起草人：钱晶晶、葛伟强、马纪忠、洪少民、胡能兵、杨友婷、崔广荣、姚登波、洪登华、王宁、吕群龙、杨小元、韩啸。DB34/T4625—20231石榴脱毒苗木繁育技术规程本文件规定了石榴脱毒苗木组培生产过程的术语和定义、环境要求、组培技术、病毒检测和质量要本文件适用于果用、观赏石榴品种的脱毒苗木繁育。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6000主要造林树种苗木质量分级GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则LY/T1893石榴苗木培育技术规程DB34/T3410石榴生产技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1外植体explants植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。3.2石榴组培tissuecultureofpomegranates利用石榴茎尖等组织作为外植体，在无菌条件下通过人工培育出完整植株的过程。3.3茎尖脱毒virus-eliminatedofplantshoottip采用茎尖接种的离体培养方式，达到脱除植物病毒的目的。3.4褐化browning培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，影响培养物的生长、分化，甚至死亡的现象。4环境要求操作间要求由准备室、缓冲室、接种室、培养室、炼苗室和移栽温室等部分组成。其中接种室、培养室需要严格无菌，所处环境要求具备可以自动杀菌、控温、控光等条件。DB34/T4625—202324.1准备室用于药品和培养基配置、器具洗涤及灭菌等，面积≥15m2，温度为20℃~28℃。4.2缓冲室用于室外与接种室或培养室的隔离缓冲区间，应具备换衣区、风淋区，面积≥2m2。4.3接种室单间接种室面积≥10m2，高度≤3m；接种室要求严格无菌，应具备超净工作台，室内应吊装紫外线灭菌灯，距离地面1m处，其辐射强度应＞70W·cm-2；2d～3d进行1次紫外消杀灭菌，1月～2月进行1次甲醛熏蒸消杀灭菌处理；室内温度21℃~26℃,相对湿度50%～70%。4.4培养室用于组培苗的培养，面积≤50m2，方便隔离和消杀；培养室要求严格无菌，应具备培养架，室内应吊装紫外线灭菌灯，距离地面1m处，其辐射强度应＞70W·cm-2；1月～2月进行1次甲醛熏蒸消杀灭菌处理；培养室环境相对湿度70%～80%；光培养16h，22℃~26℃,光照强度2000Lux～5000Lux；暗培养8h，22℃~26℃。4.5炼苗室应具有自动喷雾或加湿设施，温度22℃~28℃、相对湿度50%～70%、光照1000Lux～5000Lux。4.6移栽温室应具有遮光设施，遮阳率25%～50%、温度15℃~25℃、相对湿度50%～70%、自然光照，光照过于强烈时采取遮光措施。5组培技术5.1技术路线组培技术路线：外植体选取→茎尖接种→扩繁培养→生根培养→病毒检测→炼苗→移栽。5.2组培流程5.2.1外植体选取选取无病虫害、长势健壮的品种作为取样母株，截取健康、幼嫩、无病虫害的新梢，放置于室内水5.2.2培养基配置培养基采用WPM为基本培养基，以6-BA、IBA为常用激素，活性炭作为去除褐化常用吸附剂，不同生长过程培养基配方如下：DB34/T4625—20233活性炭；5.2.3接种剪取茎尖顶端1.0cm～2.0cm作为接种外植体，采用0.10%HgCl2和无菌水对外植体灭菌，在接种室无菌环境下，通过解剖镜剥取长度为0.10mm～0.15mm的茎尖生长点，接种于培养基中，培养30d～40d。5.2.4扩繁用组培苗作为外植体，切去增生愈伤后，接种于扩繁培养基中，培养25d～35d。5.2.5生根剪取扩繁苗1.0cm～1.5cm的不定芽茎段作为外植体，接种于生根培养基中，插入深度0.25cm~0.35cm，培养30d～40d。5.2.6炼苗选取根长0.6cm～0.8cm、带有毛状根的组培苗，置于炼苗室，打开组培瓶盖，在光照1000Lux~2000Lux条件下炼苗1d～2d后，在光照3000Lux～5000Lux条件下炼苗2d～3d。5.2.7移栽选取炼苗后长势健壮组培苗作为移栽苗，用清水洗净根部培养基，移栽至32孔标准配制基质（草炭：蛭石：珍珠岩=3：1：1）穴盘内。移栽要求：温度22℃~28℃,相对湿度30%～50%，自然光照条件。5.2.8田间管理按照GB/T8321（所有部分）和LY/T1893的规定执行。5.2.9苗木出圃按照DB34/T3410的规定执行。6病毒检测6.1石榴苗木病毒主要检测对象如下：——石榴花叶病毒（PoMv,Pomegranatemosaicvirus）；——李坏死环斑病毒石榴花叶株系（PNRSV,Prunusnecroticringspotvirus,pomegranatemosaicstrain）。6.2样本抽样6.2.1移栽苗木抽样DB34/T4625—20234采用随机取样法，抽取移栽苗木进行病毒检测。以1千株为基数（＜1千株的，以1千株计算），1万株内（含1万株每增加1千株增检10株，≥1万株，每增加1千株增检2株。抽样检测时间为移栽成活后3月～6月内。6.2.2出圃苗木抽样采用随机取样法，抽取出圃苗木进行病毒检测。以1万株为基数1万株的，以1万株计算10万株内（含10万株），每增加1万株增检5株，≥10万株，每增加1万株增检2株。6.3检测方法推荐使用反转录——聚合酶链式反应检测法（RT-PCR），选用试剂盒进行RNA提取及RT-PCR检测。推荐引物见表1。表1推荐RT-PCR法检测病毒对象及引物序列CTGTACCACACTGAAAATATATGCTTGATAACATATTTTCAGT6.4样品保存抽取样品后，要求抽取样品一式两份，一份用于检测，一份由密封袋标记好时间、地点、样品名称后，放置于-80℃冰箱中冻存备份。6.5病毒检测要求6.5.1移栽苗移栽苗木检测，其带有检测对象的病毒株允许率≤0.1%。6.5.2出圃苗出圃苗木检测，其带有检测对象的病毒株允许率＜0.3%。7质量要求7.1抽样要求按照GB6000的规定执行。7.2检验规则按照