DB43∕T 1727-2019 柑橘半穿刺线虫检疫鉴定LAMP法

ICSICS65.020湖南省地方标准柑橘半穿刺线虫检疫鉴定LAMP法IdentificationandquarantineofTylenchulussemipenetranswithloop-mediatedisothermalamplificationmethod2019-12-31发布2020-03-01实施湖南省市场监督管理局发布DB43/T172720192缩略语和符号—————————--——--———————————————— 13方法与原理 -—--—————--—---————--——-————-—14柑橘半穿刺线虫————————-—————————————————————-25试剂 -—--—————--—---————--——-————-—26仪器和设备 -—--————--—---————--——-————-—27检测方法 -—--———--—---——--—---——-3 结果判定与表述—-————-——-————-——--———— 余样处理 -—-——-——--———--—---——-95附录A柑橘半穿刺线虫背景资料 -—(资料性附录)6附录B柑橘半穿刺线虫DNA样品提取 -—(规范性附录)9附录CLAMP 1(规范性附录)扩增反应混合液配制方法(25反应体系)0DB43/T17272019前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省农业农村厅提出。本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草人:成飞雪、刘勇、张德咏、王东伟、王剑、宋志强、吴顺银、龙坤志。DB43/T17272019柑橘半穿刺线虫引起的柑橘慢衰病是柑橘上一种重要病害,对柑橘生产造成了严重威胁。制定柑橘半穿刺线虫简单、快速检测鉴定技术标准,准确鉴定与识别柑橘等寄主植物根或根围土壤中柑橘半穿刺线虫,是保障我省柑橘产业稳定发展的迫切需要本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到5.1引物序列及7.4.1反应体系与用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人己向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下,就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得:专利持有人:湖南省植物保护研究所地址:湖南省长沙市芙蓉区马坡岭农科院请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任DB43/T172720191柑橘半穿刺线虫检疫鉴定LAMP法器和设备、检测方法、结果判定与表述等技术内容。本标准适用于柑橘半穿刺线虫的简单、快速检测鉴定。2缩略语和符号下列缩略语和符号适用于本标准。2.1LAMPIOOP-mediatedisothermaamplification环介导等温扩增。dNTPSMixturEdeoxyribonucIEosidetriphosphatesmixture脱氧核苷三磷酸混合液。双蒸水。TS-F3(forwardouterprimer)正向外引物。TS-B3(backwardouterprimer)反向外引物。TS-FIP(forwardinnerprimer)正向内引物。2.7TS-BIP(backwardinnerprimer)反向内引物。TS-LB(backwardloopprimer)环引物。3方法与原理LAMP是一种恒温核酸扩增方法。利用该方法实现核酸的大量扩增,产物通过加入荧光染料后经肉2DB43/T17272019眼观察颜色的变化来判定结果。以含有柑橘半穿刺线虫的柑橘或其他寄主植物根或根围土壤为供试样品,提取含有柑橘半穿刺线虫的根DNA或土壤总DNA,可用于检测。4柑橘半穿刺线虫柑橘半穿刺线虫的分布、危害及其形态特征等参见附录A。5试剂5.1检测引物序列5.1.1Ts-F3:5'-CCAGGTTGAGCAGAGTTCTT-3,5.1.2Ts-B3:5'-GCCGTTTTCGCCTGTAGTC-3'5.1.3Ts-FIP:5-CAGATGCCAGAAGCAGCGACAGGCACATCGGGTGAAGAG-3'5.1.4Ts-LB:5'-GAGGAAGGGGTACTGAGCTT-35.1.5Ts-LB:5'-GAGGAAGGGGTACTGAGCTT-3,5.2FastDNASpinkitforsoil试剂盒,MPBiomedicals公司5.3其他试剂10XEasyTaqBuffer(反应缓冲液,含Mg2+),dNTPS(各10mmo1/L),EasyTaqDNApolymerase(DNA聚合酶),Trans2kplusIIDNAMarker,SYBRgreenI,Tris-HC1,酚/氯仿,无水乙醇,蛋白酶K,NaAC,Nacl,EDTA,CATB,β巯基乙醇。除另有规定外,所有试剂均为分析纯试剂。6仪器和设备6.1恒温水浴锅要求有显示温度功能。相对离心力在15000g以上。6.3微量加样器4℃-10℃和-20℃。0.0001g精确度以上。6.6其他仪器及耗材高压灭菌,振荡器、锅离心管、PCR反应管、Tip头、10ml、100mL容量瓶以及100mL细口试剂瓶、采样袋、取土器。DB43/T1727201937检测方法7.1样品采集观察地上部分具有柑橘慢衰病症状的柑橘树,选取柑橘根围5个采样点,刨开地表土层,用取样器取20CM-30CM土层深度的土壤或根系100g左右,混匀、编号、备检。7.2柑橘半穿刺线虫DNA样品提取含半穿刺线虫的土壤DNA提取使用MPBiomedicals公司的FastDNASPINKitforsoil试剂盒,根样中DNA的提取采用酚/氯仿抽提法,具体操作见附录B。提取的含有柑橘半穿刺线虫DNA的土壤总DNA或根样DNA,用于LAMP检测。每个样品至少设置3个重复处理。7.3对照材料7.3.1阳性对照用已知含有柑橘半穿刺线虫的土壤或根样DNA样品做阳性对照。7.3.2阴性对照用已知不含柑橘半穿刺线虫的土壤或根样DNA样品做阴性对照。7.3.3空白对照用等体积的无菌ddH0代替样品做空白对照。7.4检测7.4.1检测设计每次检测设置阳性对照、阴性对照和空白对照。7.4.2准备在冰上融化各反应组分,手指弹匀或是低速离心混匀(约2500rpm/Min下离心5s-10s),根据检测样品数量,计算好各试剂的使用量,每份样品至少设置3个平行反应。7.4.3反应体系除DNA样品外,按照附录C方法配制反应混合液,所有试剂全部加入0.5-1mL离心管中,充分混匀后,盖上离心管并迅速低速离心。打开离心管盖子,用微量加样器向每个PCR管中各分装24.0μL。再在已设定的PCR管中分别加入提取的DNA样品1.0μL。空白对照管中加入1.0μL无菌ddH20代替样品DNA。盖上PCR管的盖子,低速离心7.4.4荧光染料的加入再次打开PCR反应管盖子,使用量程为0.1UL-2.5μL的微量加样器,在PCR反应管盖的内表面,加入1.0uLSYBRGreenI(1000X)显色剂,盖上PCR反应管。DB43/T172720194将上述加样后的PCR管放在水浴漂浮板上,放入水浴锅,在63℃下恒温温育75min,然后在82℃下保温5Min终止反应。7.4.6结果观察迅速低速离心,观察PCR反应管颜色,进行结果判定。8结果判定与表述8.1有效实验8.1.1阳性对照PCR反应管中肉眼观察反应液呈现绿色。8.1.2阴性对照PCR反应管中肉眼观察反应液呈现褐色。8.1.3空白对照PCR反应管中肉眼观察反应液呈现褐色。8.1.4实验有效性判别当阳性对照、阴性对照和空白对照都符合图1显色反应时,实验为有效实验,否则视为无效实验。图1LAMP显色反应注:1-3为样品,4为阳性对照,5为阴性对照,6为空白对照8.2检测结果8.2.1阳性结果观察PCR反应管中的颜色反应结果,其中有目标扩增产物的LAMP反应液呈现绿色,判定为阳性,3次重复中至少有一次为阳性,说明土壤或根样中含有柑橘半穿刺线虫,表述为"该试样中检出柑橘半穿刺线虫"。8.2.2阴性结果DB43/T172720195没有目标扩增产物的LAMP反应液不显示绿色而是褐色,判定为阴性,样品的3次重复中都呈现阴性,表示该样品中不含柑橘半穿刺线虫,表述为"该试样中未检出柑橘半穿刺线虫"。9余样处理对检测后剩余的样品,利用高温进行无害化处理。将样品放干燥箱中80℃处理30min-1h,杀死柑橘半穿刺线虫。DB43/T17272019(资料性附录)柑橘半穿刺线虫背景资料A1柑橘半穿刺线虫的分布、寄主范围及危害特征柑橘半穿刺线虫Tylenchulussemipenetranscobb,属于线虫门(Nematoda),侧尾腺纲 (secernentea),垫刃目(Tylenchida),环总科(criconematoidea)、半穿刺亚科(Tylenchulidae),半穿刺属(Tylenchulus)。是一种专化性强的定居型半内寄生线虫,侵染柑橘引起柑橘慢衰病(citrus一般减产30%-50%,严重时达100%。在我国湖南、湖北、广东、广西、福建、四川等柑橘产区都发现有柑橘半穿刺线虫的分布和危害。如湖南永州柑橘产区,柑橘半穿刺线虫分布普遍,样品病原检出率达到82.1%,且种群密度大,是引起柑橘黄化症状的主要原因之一;福建省5个重要柑橘产区柑橘半穿刺线虫果园发病率为74.6%,果园株发病率为5%-100%。柑橘半穿刺线虫寄主范围较广,能够寄生50多种柑橘品种及其杂交种,还可侵染葡萄、草莓、荔枝、橄榄、桃、梨、龙眼、芒果、苹果、柿、板栗、杉木、九里香等植物柑橘半穿刺线虫侵染寄主后,常造成寄主植物活力减退,叶片褪绿黄化,长势衰弱似缺肥、缺水、生长不良症状,严重时叶片脱落,果实变小,产量降低,甚至枯死(图2)。同时半穿刺线虫侵染柑橘后,破坏寄主植物根的皮层,造成伤口,利于真菌、细菌等病原物的入侵,加重对柑橘的危害。柑橘半穿刺线虫的生活史包括卵、一龄幼虫在卵内发育,孵化出来即为二龄幼虫。柑橘半穿刺线虫的二龄幼虫是其侵染龄期。二龄幼虫作为侵染虫态,主要从新根延长区侵入寄生,少数从分生区侵入。虫体前端插入根皮组织固定,形成固定的取食点、吸取寄主汁液。在7-10d中完成从二龄幼虫到成虫的发育,雌成虫后端膨大外露,进行孤雌生殖,将卵产于胶质卵囊中。其发育历期受寄主、土壤质地、气候等条件影响,在24-26℃条件下6-8周可完成一次生活史。柑橘半穿刺线虫种群密度与寄主、温度和土壤等因素密切相关。雌成虫集中分布在5CM一30CM的须根上,二龄幼虫则多分布在0cm-45cm的土层中。春季和秋季是柑橘半穿刺线虫种群密度和雌虫产卵的高峰期。带土苗木是柑橘半穿刺线虫进行远距离传播的主要途径eDB43/T172720197图2柑橘半穿刺线虫引起的慢衰病症状A2柑橘半穿刺线虫形态特征柑橘根组织中的柑橘半穿刺线虫雌虫在体视显微镜下用细解剖针直接剥离;土壤中二龄幼虫和雄虫采用浅盘法分离。将雌虫以及分离获得的二龄幼虫和雄虫经缓慢加热杀死后,用TAF固定液固定,制成临时玻片,于光学显微镜下进行形态观察、拍照。采用deMan公式进行形态测计,其中:n=样本数;L=体长;stylet=口针长;Tail=尾长;spicule=交合刺长度;a=体长/最大体宽;b=体长/头端至食道与肠连接处的距离;C=体长/尾长;C'=尾长/肛门或泄殖腔处体宽;V=阴门至头端的距离/体长X100;D60=背食道腺开口至口针基部球的距离。雌虫:成熟雌虫与雄虫异形,虫体前部潜入根组织内,后部外露于根表面,膨大呈囊状(图3a)。头部骨化弱,口针中等发达,基部球大而圆(图3b)。具两个弯曲的卵巢,阴门向腹面斜裂,近尾端,产卵于胶质卵囊中。排泄孔位于阴门前附近(在体长的60%以后),无直肠和肛门。尾端有一指状突起 (图3c)。雄虫:虫体蠕虫形,纤细(图3d)。唇区圆形。口针纤细,有基部球。食道细长,中食道球退化,食道腺呈洋梨形,与肠交界明显(图3e)。交合刺细,无交合伞。尾圆锥形,末端稍钝(图3f)。二龄幼虫:虫体蠕虫形(图3g)。头部骨质化,口针较发达,有基部球。中食道球大,食道腺与肠基本平接或略覆盖肠(图3h)。尾渐细,末端钝圆(图3i)。测计值:雌虫:n=20,L=379.2(350.1-410.5)um;a=4.7(4.0-5.3);b=3.0(2.7-3.4);V=90.1(87.3-93.0);stylet=12.1(10.5-13.3)m。雄虫:n=20,l=360.0(317.9-410.1)m;a=33.9(29.2-45.6);b=3.2(2.9-3.5);C=8.7(7.7-10.1);C'=4.9(4.0-5.6);stylet=10.2(9.4-11.1)ym;spicule=19.1(16.8-21.5)DB43/T172720198二龄幼虫:n=20,L=379.6(337.1-414.5)m;b=3.4(3.1-3.7);stylet=13.8(13.0-14.7)图3柑橘半穿刺线虫的形态特征图注:a:侵染柑橘根系的4龄幼虫和雌成虫;b:雌虫整体;C:雌虫体后部;d:雄虫整体;e:雄虫体前部;f:雄虫尾部;g:2龄幼虫整体;h:2龄幼虫体前部;i:2龄幼虫体后部(a、b、d和g图标尺=20lM,其余图标尺=10lm)DB43/T17272019(规范性附录)柑橘半穿刺线虫DNA样品提取B1土壤样品柑橘半穿刺线虫DNA样品提取含有半穿刺线虫的土壤DNA提取使用MPBiomedicals公司的FastDNASPINKitforsoil试剂盒,具体操作步骤如下:a)向LysingMatrixE管中加入0.5g土壤样品,加入978uLSodiumphosphateBuffer和122yLMTBuffer,并振荡处理处理40S,14,000rpm/min离心10Min,转移上清至一个洁净的2ml离心管中。b)加入250uLPps,用手来回晃动10次,使其混合,14,000rpM/min离心5min,转移上清至一个洁净的2mL离心管中;并吸取1mL摇匀后的BindingMatrix溶液加入到离心管中。将离心管上下颠倒振荡2min使DNA结合,静置3min,使DNA附着到BindingMatrix上,以及等待si02基质沉淀。C)弃掉500uL上清液,避免吸出沉淀物。将剩下的上清液重新混匀,并转移混合物至SPINFilter中,14,000rpm/min离心1min,倒掉收集管中的液体;d)加入500uLSEWS-M溶液,