人工细胞工厂设计构建 课件 第10章 人工放线菌细胞工厂

第10章人工放线菌细胞工厂10.1概述10.2常用元件与构建工具

10.3红霉素细胞工厂10.4靛蓝细胞工厂人工放线菌细胞工厂10.1概述概述人工放线菌细胞工厂10.1.1细胞结构与功能布局10.1.2基因组与遗传特点10.1.3生理与代谢特点10.1.4应用与进展细胞结构与功能布局放线菌主题/重点：放线菌、菌丝、孢子、链霉菌10.1.1细胞结构与功能布局生物学分类放线菌（Actinomycetes）是一类能形成分支状菌丝和分生孢子的原核微生物，固体培养基的菌落呈放射状，故名放线菌。细胞结构特征具有细菌的细胞结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、拟核等。细胞壁含有胞壁酸、内消旋二氨基庚二酸，但不含几丁质、纤维素，革兰氏阳性。一般不形成荚膜、菌毛等特殊结构。多数放线菌的菌丝像霉菌一样纤细和分支，但无隔膜，无核膜，含有多个拟核区，整个细胞质都是贯通的，为典型的多核单细胞丝状体。细胞结构与功能布局放线菌主题/重点：高GC含量基因簇稀有密码子10.1.2基因组与遗传特点高GC含量，链霉菌属（Streptomyces）的GC含量为72%，假诺卡氏菌（Pseudonocardia）的GC含量高达79%基因组是一条线状染色体，一般为7～12Mb。通常在染色体外还存在环型质粒和线型质粒。线性染色体和质粒的5'末端具有长短不一的反转重复序列，其末端接合蛋白。Streptomyces

基因组DNA示意图细胞结构与功能布局放线菌10.1.2基因组与遗传特点模式种天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor)的线性染色体大小为8.7Mb，编码7800多种蛋白，63个tRNA基因。基因组中除了基础代谢基因外，还具有数十个次级代谢产物合成基因簇，主要编码聚酮类和非核糖体肽类等天然产物。最长的次级代谢产物基因簇可达100kb以上。次级代谢产物合成基因簇是由抗性基因、外排基因、途径特异性调控基因和结构基因组成结构基因决定了产物的化学结构，抗性基因、外排基因和调控基因决定了产物的产量。Streptomycescoelicolor基因组基因组与遗传特点放线菌起始密码子：AUG占65%、GUG占32%、UUG占3%终止密码子：主要是UGA，其次是UAG和UAA氨基酸密码子频率(‰)氨基酸密码子频率(‰)氨基酸密码子频率(‰)氨基酸密码子频率(‰)苯丙氨酸UUCUUU25.90.4半胱氨酸UGCUGU7.10.7酪氨酸UACUAU15.90.1蛋氨酸AUG15.8色氨酸UGG15.2亮氨酸CUGCUCUUGCUUCUAUUA60.9036.52.41.60.40.1丝氨酸

UCCUCGAGCAGUUCAUCU20.213.712.51.51.10.6精氨酸

CGCCGGCGUAGGCGAAGA39.131.95.53.72.60.8异亮氨酸

AUCAUAAUU27.50.70.6终止密码UGAUAGUAA2.40.50.1脯氨酸CCGCCCCCUCCA33.425.51.61.4苏氨酸ACCACGACAACU39.819.01.71.2甘氨酸

GGCGGGGGUGGA60.918.29.27.2组氨酸

CACCAU21.81.7谷氨酰胺CAGCAA25.21.4缬氨酸GUCGUGGUAGUU46.935.02.71.5丙氨酸GCCGCGGCAGCU78.449.55.63.1天冬氨酸GACGAU58.23.1天冬酰胺

AACAAU16.30.7谷氨酸GAGGAA48.28.7赖氨酸AAGAAA19.61.1天蓝色链霉菌密码子的使用频率分布基因组与遗传特点放线菌稀有密码子UUAleu只能被唯一的tRNA基因bldA编码，该tRNA对于生长是非必需的，但对形态建成和次级代谢是必需的，其表达受到时空调控。2～3%基因含有TTA密码子，次级代谢途径中的很多基因都含有TTA密码子，这些基因严格受到翻译水平调控。在链霉菌中表达异源基因时需要注意TTA密码子。生理与代谢特点放线菌生理特性碳源：各种糖类：优先利用碳源是葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉和甘油，其次蔗糖、木糖和棉子糖等。温度：最适生长温度为25～37℃，生物医药工业放线菌的适宜生长温度为28～32℃。对于高温放线菌，其生长温度范围为50～65℃。放线菌适宜中性和偏碱性条件，pH范围为7.0～9.0。主题/重点：好氧次级代谢产物生理与代谢特点放线菌氮源：能以蛋白质、蛋白胨为氮源，也能利用硝酸盐、铵盐和尿素。除诺卡氏菌外，绝大多数放线菌都能利用酪蛋白，并能液化明胶。好氧生物：工业发酵过程中需要通入无菌空气次级代谢：合成结构复杂、生物活性多样的次级代谢产物，如聚酮类、非核糖体肽类、氨基糖胺类、核苷类等。放线菌合成次级代谢产物与菌丝形态分化密切关联，并受到复杂的网络调控。放线菌次级代谢产物合成的调控主要发生在转录水平，涉及全局转录因子、多效转录因子和途径特异性转录因子等，形成不同层级的调控网络。主题/重点：好氧次级代谢产物丰富应用与进展放线菌主题/重点：抗生素聚酮类天然产物主要应用产品：各种抗生素的生产。工业上，链霉菌合成了90%的放线菌抗生素10.2常用元件与构建工具人工放线菌细胞工厂10.2.1常用元件10.2.2常用质粒10.2.3遗传转化方法10.2.4构建工具常用元件与构建工具常用元件主题/重点：表达元件质粒结合转移10.2.1常用元件与构建工具启动子：启动子是富AT序列，包括组成型启动子和诱导型启动子启动子启动子特征PermE*来源于红霉素抗性基因ermE的启动子突变体，组成型较强启动子，广宿主，用于异源表达和沉默基因簇激活PRorpsL核糖体蛋白L基因的启动子，组成型较强启动子PElgapdh来源于肠道放线菌（Eggerthellalenta）的三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子，组成型较强启动子PkasO*来源于转录调控因子基因kasO的启动子突变体，强启动子，比PermE*高2~5倍。广宿主，用于异源表达PSP系列基于PkasO的人工设计合成的启动子，组成型超强启动子，比PermE*高10倍以上Ptcp830合成型四环素诱导启动子，受TetR阻遏调控，活性高，诱导剂使用浓度低（1~100ng/ml）,应用广PtipA硫链丝菌素诱导启动子，受TipAL激活调控，本底表达较高，应用受限PnitAƐ-己内酰胺（Ɛ-caprolactam）诱导启动子，受NitR阻遏调控PA3rolO间苯二酚（resorcinol）诱导启动子，来源谷氨酸棒杆菌的合成型启动子，受RolR阻遏调控，，本底表达低，100uM以上间苯二酚对细胞有毒性P21cmt对-异丙基苯甲酸（cumate）诱导启动子，来源恶臭假单胞杆菌的合成型启动子，受CymR阻遏调控，本底表达低，活性比PA3rolO高2倍常用元件10.2.1.2核糖体结合位点放线菌的RBS为富嘌呤序列，在AGT上游6～15位，保守RBS序列为AAGGAG，Ｃ或Ｔ的引入将降低RBS的活性。RBS的活性可用通过设计其两侧的7bp序列进行调节，使活性增加1倍左右。已经有放线菌的RBS文库报道，在实际构建中，可选择使用。常用元件与构建工具常用元件10.2.1.3终止子次级代谢产物基因簇中都存在终止子。启动子与终止子共同驱动基因表达。组成型基因的终止子具有一定的本底表达，而异源基因的终止子往往具有较低的泄露表达。常用异源的B1006、fd、λt0、T7终止子。放线菌中终止子的表证不足，对基因表达的影响有待深入研究，元件有待开发。常用元件与构建工具常用元件10.2.1.4选择标记元件抗生素抗性基因。在培养基中添加一定浓度的抗生素，实现对质粒的有效筛选和富集。常用元件与构建工具筛选标记元件筛选机理常用浓度TsrR硫链丝菌素抗性基因，编码23SrRNA甲基化酶，提高翻译耐受性100µg/mlaac(3)IV，AprR安普霉素抗性基因，编码乙酰转移酶，修饰抗生素使之失活50µg/ml

ermE，EryR

红霉素抗性基因，编码23SrRNA二甲基化酶，提高翻译耐受性50µg/mlaacC1，GenR庆大霉素抗性基因，编码乙酰转移酶，修饰抗生素使之失活50µg/mlaph，HygR潮霉素抗性基因，编码磷酸转移酶，修饰抗生素使之失活50µg/mlcodA将5-氟胞嘧啶转化为由毒性的5-氟尿嘧啶，用于反筛800µg/ml常用质粒常用元件与构建工具10.2.2常用载体载体类型载体名称筛选标记特点游离载体

pUWLTsrRpIJ101复制子，分配不稳定，attP-ΦC31int,lacZα多克隆位点，pUC18oripKC1139aac(3)IVpSG5复制子，温敏型载体，RK2oriT,attP-ΦC31int,lacZα多克隆位点整合载体

pSET152aac(3)IVRK2oriTattP-ΦC31int,lacZα多克隆位点pIB139aac(3)IV来源于pSET152,RK2oriT,attP-ΦC31int,PermE*插入到多克隆位点上pStreptoBACVaac(3)IVRK2oriT,attP-ΦC31int,BamH位点，可承载200Kb，适合于基因簇克隆与表达pOSV806HygRattP-φC31int，两个FRT位点，RK2oriT，蓝色蛋白基因pOSV809KanRattP-φC31int，两个FRT位点，RK2oriT，蓝色蛋白基因放线菌中使用的载体包括游离载体和整合载体（穿梭载体）遗传转化方法放线菌中常用接合转移和原生质体转化的方法进行转化。接合转移：利用大肠杆菌与放线菌的接触、融合，将质粒转移到放线菌中的转化方法。常用大肠杆菌甲基化缺陷型菌ET12567/pUZ8002、大肠杆菌S7-1作为供体菌主题/重点：转化结合转移原生质体融合常用元件与构建工具结合转移转化的过程示意图10.2.3

遗传转化方法遗传转化方法原生质体转化：通过制备原生质体，将DNA与原生质体一起孵育，使DNA进入原生质体的转化方法。通过原生质体的再生获得重组菌株。常用元件与构建工具10.2.3

遗传转化方法链霉菌原生质体的示意图构建工具主题/重点：同源重组基因组编辑10.2.4.1位点特异性重组工具核心attB位点是约34bp长的反向回文结构。含有attP和ΦC31整合酶基因的载体转化后，则发生位点特异性重组，整个载体被插入到attB位点上。除了attB位点外，还具有多个假attB（pseudo-attB）位点，它们也能发生重组，但效率偏低。不同整合酶的整合位点序列是不同的，整合酶与整合位点必需配合在一起使用。常用元件与构建工具构建工具10.2.4.2同源重组工具放线菌自身具有一定的同源重组能力，可进行基因敲除和整合。与大肠杆菌相比，需要更长的同源臂，一般情况下需要同源臂2～4kb。即使同源重组能力较强的放线菌，同源臂也要在600bp以上，以提高重组效率。接合转移后，载体的同源臂与放线菌的基因组之间发生两次交换，将载体序列整合在基因组上。Cre/loxP或Flp/FRT位点特异性重组系统。常用元件与构建工具放线菌染色体同源重组敲除交换原理示意图构建工具10.2.4.3CRISPR编辑工具基因组编辑工具箱CRISPR-Cas、CRISPRi、CRISPRa及单碱基编辑器化脓链球菌Cas9在放线菌中可成功使用过表达连接酶D基因，能提高编辑效率温敏性质粒：便于编辑后消除质粒用dCas替换cas基因，设计gRNA序列，构建CRISPRi系统将dCas的C末端与RNA聚合酶a亚基的N端序列进行融合，构建CRISPRa系统将dCas基因与脱氨酶基因、尿嘧啶DNA糖基化酶酶抑制剂（UGI）基因融合表达，构建单碱基编辑工具常用元件与构建工具CRISPR-Cas编辑放线菌基因组流程示意图10.3红霉素细胞工厂红霉素细胞工厂10.3.1理化性质及应用10.3.2细胞工厂的设计10.3.3细胞工厂的构建10.3.4发酵工艺优化理化性质及应用红霉素细胞工厂红霉素红霉素Erythromycin红霉素是红色糖多孢菌（Saccharopolysporaerythraea）产生的14元大环内酯类抗生素，分子式C37H67O13，分子量733.9红霉素呈白色或类白色结晶或粉末，无臭，味苦，微有引湿性。红霉素易溶于甲醇、乙醇或丙酮中，微溶于水。1952年批准上市，临床主要用于对青霉素过敏患者的细菌感染治疗，如溶血性链球菌、肺炎链球菌等所致的扁桃体炎、咽炎、鼻窦炎、猩红热；白喉、坏疽、炭疽、梅毒、支原体肺炎、衣原体肺炎，泌尿生殖系感染和沙眼衣原体结膜炎我国是红霉素原料药生产和出口国，年产量约1.4万吨理化性质及应用红霉素细胞工厂10.3.2红色糖多孢菌能降解或水解酪蛋白、明胶、淀粉、尿素等，能还原硝酸盐，但不能在含有水杨酸的培养基生长。能分解代谢乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸，不能代谢苯甲酸、粘液酸、草酸和酒石酸。生长温度为20～42°C，适宜温度32℃。红色糖多孢菌NRRL23338的基因组，一条环形染色体，长度8212805bp，平均GC含量71.1%，预测含有7624个基因，编码7198种蛋白22种次级代谢产物基因簇，包括10种聚酮、7种非核糖体肽和5种萜类，总长度447.447kb。Saccharopolysporaerythraea红霉糖多孢菌红霉素细胞工厂10.3.3红霉素生物合成途径红霉素生物合成基因簇（ery）全长约56kb，有21个基因包括3个Ⅰ型聚酮合酶（TypeIpolyketidesynthase）基因（eryA1、eryA2和eryA3），13个稀有糖基合成基因、1个氧化、2个甲基化因和1个红霉素抗性基因理化性质及应用红霉素细胞工厂10.3.3红霉素生物合成途径理化性质及应用红霉素生物合成可分为3个阶段第1个阶段是红霉素骨架6-脱氧红霉内酯B合成第2个阶段是糖基合成第3个阶段是氧化、甲基化、糖基化修饰红霉素第1阶段合成途径红霉素细胞工厂10.3.3红霉素生物合成途径-红霉素第2阶段合成理化性质及应用dTDP-L-碳霉糖和dTDP-D-脱氧糖胺的生物合成红霉素细胞工厂10.3.3红霉素生物合成途径-红霉素第3阶段合成理化性质及应用红霉素A的合成途径红霉素C细胞工厂的设计红霉素细胞工厂细胞工厂设计主要从红霉内酯前体合成途径、稀有糖合成途径和全局转录调控三个方面进行设计红霉内酯的前体合成途径设计增强琥珀酰CoA合成加强脂肪酸氧化途径，提高乙酰CoA合成加强支链氨基酸降解途径敲除丙酰转移酶基因AcuA，解除丙酰辅酶A合成酶的反馈抑制，提高前体丙二酰辅酶A供应细胞工厂的设计红霉素细胞工厂红霉素合成基因簇的表达设计强化合成基因的表达：在eryBIV至eryBVII的操纵子内部，存在3个弱启动子，分别在eryBIV、eryCVI、eryBVI之前，使eryBIV-BV、eryCVI、eryBVI-CIV形成转录单元强化糖基合成：L-碳霉糖和D-脱氧糖胺的合成基因分散在基因簇中，转录水平较低限制了红霉素产量增加主产物比例：强化EryK和EryG的催化活性和底物选择性，调控两个基因的拷贝数细胞工厂的设计红霉素细胞工厂全局转录调控设计已经鉴定了多个转录因子基因，直接结合红霉素合成基因启动子，或通过其他转录因子间接抑制或激活红霉素生物合成基因簇BldD直接结合红霉素生物合成基因簇的5个转录本的启动子上，激活红霉素的合成SACE_0303间接激活红霉素的合成SACE_7301直接结合eryAI和ermE基因启动子激活转录转录因子SACE_3446直接阻遏eryAI和ermE转录SACE_3980直接结合eryAI、eryBI、eryBIII、eryBVI、eryCI、eryK的启动子，在生长前期阻遏红霉素生物合成转录因子SACE_4839、SACE_5754间接阻遏eryAI和ermE基因转录细胞工厂的构建红霉素细胞工厂基因组整合过表达α-酮戊二酸脱氢酶基因sucBA和甲基丙二酰辅酶Ａ操纵子mut增加甲基丙二酰辅酶A的供应使用CRISPRi技术抑制sucC表达增加三羧酸循环的通量：在辅酶A较多时，SucCD催化生成的琥珀酰辅酶A使顺乌头酸酶发生琥珀酰化修饰，降低了三羧酸代谢酶活性抑制或敲除mutB使代谢流向甲基丙二酰辅酶A调控脂肪酸氧化降解途径或过表达乙酰辅酶A羧化酶基因、丙二酰辅酶羧化酶基因增加甲基丙二酰辅酶A合成敲除pccD基因和过表达丙酰辅酶A羧化酶基因，通过加强支链氨基酸降解途径，增加甲基丙二酰辅酶A供应敲除丙酰化修饰基因（如SACE_3848）、过表达丙酰辅酶A合成酶基因（如SACE_1780）并解除丙酰化的反馈抑制，提供丙酰辅酶A前体强化前体供应细胞工厂的构建红霉素细胞工厂强化红霉合成基因簇的转录用异源启动子原位替换eryCIV、eryBVI、eryCVI、eryBV、eryBIV和eryBIII的原始启动子采用基因拷贝数效应，优化基因EryG、EryK的表达量，而从减少或消除副产物红霉素B和红霉素C的生成。设计eryK/eryG拷贝数为3:2，副产物红霉素B和红霉素C几乎完全消除，全部转化为红霉素A细胞工厂的构建红霉素细胞工厂红霉素生物合成的全局转录调控表达框内敲除负调控基因，以免引起后续基因表达的极性效应。构建激活或正调控ery的转录因子基因，整合在染色体上。对级联调控的转录因子，则需要敲除和过表达同步进行，以实现全局调控效应的最大化。举例：SACE_4839和SACE_4838组成红霉素合成的级联调控，SACE_4839直接抑制SACE_4838基因转录，SACE_4838直接抑制SACE_4839基因转录，但间接正调控eryAI和ermE基因转录，因此敲除SACE_4839基因，同时过表达SACE_4838基因发酵工艺优化培养基C源、N源优化C源:葡萄糖和淀粉为混合碳源，效果与使用葡萄糖相似。糖浓度控制在1.0％～1.4％范围内，定时补料流加碳源（葡萄糖和丙醇），在放罐前12～18h停止。N源：有机氮源，以黄豆饼粉、玉米浆为最佳。黄豆饼粉发酵时泡沫较多，种子罐及发酵罐后期补料用部分花生饼粉代替，但全用花生饼粉则最终产品会出现带会现象。在发酵培养基中加少量硫酸铵，可促进菌丝生长。发酵过程中流加氮源，放罐前24h停止补氮。以有机氮源为主进行流加，以无机氮为辅，如氨水或硫酸铵，减少脱水红霉素的形成。温度和pH控制红霉素发酵采用31℃恒温培养。温度过高时，会产生红霉素C。整个发酵过程中pH维持在6.6～7.2。溶氧控制红霉素发酵为好氧发酵，通气和搅拌级联控制。搅拌速度不宜太快，以免损伤菌丝，不利于发酵。红霉素细胞工厂10.4靛蓝啶细胞工厂人工放线菌细胞工厂10.4.1理化性质及应用10.4.2靛蓝啶的生物合成途径10.4.3细胞工厂的设计10.4.4细胞工厂的构建10.4.5发酵工艺优化理化性质及应用靛蓝啶细胞工厂主题/重点：天然蓝色素染料理化性质靛蓝啶是一种无毒的天然蓝色素，最大吸收波长为590nm，具有蓝色鲜艳、稳定性及可生物降解的属性，能够从源头解决化学染料污染问题。靛蓝啶是水不溶性色素，可溶解于二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、吡啶、N-甲基吡咯烷酮等有机溶剂市场应用食品、制药、印染、涂料等行业有机半导体材料，在太阳能、信息产业和液晶材料等领域具有应用前景靛蓝啶化学结构式靛蓝啶