人工细胞工厂设计构建 课件 第11章 人工酿酒酵母细胞工厂

【第11章】人工酿酒酵母细胞工厂11.1概述11.2常用元件与构建工具

11.3纤维素乙醇细胞工厂11.4香茅醇细胞工厂11.5二氢青蒿素酸细胞工厂11.6长春碱细胞工厂人工酿酒酵母细胞工厂11.1概述概述酿酒酵母细胞工厂11.1.1细胞结构与功能布局11.1.2基因组与遗传特点11.1.3生理与代谢特点11.1.4应用与进展细胞结构与功能布局酿酒酵母酿酒酵母-模式真核生物图11-1酿酒酵母菌落、细胞形态和结构示意图在人工细胞工厂的应用领域，最常用于生产菌株构建的是BY系列菌株和CEN.PK系列菌株；酿酒酵母含有多种特殊的亚细胞器，这些亚细胞器具有其独特的物理化学环境(例如pH值和氧化还原电位)、酶、代谢物和辅助因子，为亚细胞器分配代谢途径提供便利条件。基因组与遗传特点酿酒酵母酿酒酵母基因组与遗传特点酿酒酵母基因组是第一个被测序的真核生物基因组(1996年;并于2010年更新)。单倍体酿酒酵母基因组包含有16条染色体（n=16），基因组总序列为12.052Mb，共包括6275个基因，其中5885个基因可编码蛋白，即全基因组平均每隔2kb就存在一个可以编码蛋白质的基因。72%的核苷酸序列是开放阅读框（OpenReadingFrames,ORF），每个ORF的平均长度是1450bp，共483个氨基酸。整个酿酒酵母的基因组约有31%的基因与人类基因组同源，11%蛋白质与新陈代谢有关，3%涉及能量生成与储存，3%参与DNA复制、修复和重组，并分别有7%、6%参与细胞核内的调控转录和翻译。约有430个蛋白质参与调控胞内物质运输及蛋白质识别标记，

250个蛋白质参与细胞结构形成。基因组与遗传特点酿酒酵母酿酒酵母遗传特点多数酵母染色体由不同程度的、大范围的GC丰富DNA序列和GC缺乏DNA序列镶嵌组成。GC含量高的区域一般位于染色体臂的中部，这些区域的基因密度较高；GC含量低的区域一般靠近端粒和着丝粒，这些区域内基因数目较为贫乏。酵母基因组含有许多DNA重复序列，其中一部分为完全相同的DNA序列，如rDNA与CUP1基因、Ty因子及其衍生的单一LTR序列等。在开放阅读框或者基因的间隔区包含大量的三核苷酸重复。还有更多的DNA序列彼此间具有较高的同源性，这些DNA序列被称为遗传丰余(geneticredundancy)。酵母多条染色体末端具有长度超过几十个kb的高度同源区，它们是遗传丰余的主要区域，这些区域至今仍然在发生着频繁的DNA重组过程。遗传丰余中的组基因往往具有相同或相似的生理功能，因而它们中单个或少数几个基因的突变并不能表现出可以辨别的表型，这对酵母基因的功能研究是很不利的。生理与代谢特点酿酒酵母酿酒酵母属于兼性厌氧微生物，易培养，可利用简单糖、无机盐、硝基氮、铵盐、酵母粉等。在繁殖时需要大量的氧气，而酒精发酵不需要氧气。酿酒酵母的生长率容易受到环境变化的影响，其中温度和pH值是两个主要方面。最佳生长温度：28-30℃最佳生长pH值：2.5-8.0应用与进展酿酒酵母在中、美、欧等国家科学家的共同努力下，实施了人工合成酵母基因组计划Sc2.0，已经完成了六条染色体的人工合成，其中天津大学合成两条，清华大学和华大基因研究院各合成了一条。随着合成生物学的发展，通过设计与构建的人工酿酒酵母细胞工厂，越来越多萜类、黄酮、生物碱等天然产物和高附加值化学品被合成出来，展示出良好的应用前景。应用与进展酿酒酵母产品主要设计与构建策略产量年份乙醇通过光遗传学电路间歇性交替过度表达PDC1和ILV2以平衡细胞代谢和产物合成41.9g/L2018香叶醇∆oye2，∆atf1，过表达tHMG,

IDI1,ERG20WW,下调ERG201.69g/L2017番茄红素引入优势crtI突变体，ARTP诱变结合过氧化氢压力筛选驱动菌株适应性进化8.15g/L20237-脱氢胆固醇dCpf1介导的转录激活过表达tHMG1、IDI1、ERG1、ERG11、

ADH2、ERG7和转录因子UPC2，CRISPRi下调ERG6、MLS1和CIT2，ERG7、ERG20、IDI1、MVD1定位到内质网2.87g/L2022吉玛烯A2×MVA，HaGAS1.3g/L2022青蒿酸对来自黄花蒿的CYP71AV1进行饱和突变，获得的8位点组合突变体45g/L2021典型人工酿酒酵母细胞工厂示例产品主要设计与构建策略产量年份二氢青蒿酸过表达MVA,优化DBR21.7g/L2020法尼烯过表达MVA,PGal表达大豆来源的FSSO，敲除DPP110.4g/L2021角鲨烯在线粒体中过表达MVA，过表达胞质tHMG,用PHXT7调控ERG121.1g/L2021柚皮素敲除内源EXG1和SPR1，过表达糖基转移酶基因UGT733C6，强化UDP-葡萄糖和莽草酸途径1.18g/L2022长春质碱下调ERG9和ERG20，ERG20WW与tCrGES融合，强化辅因子（如NADPH、SAM以及CYP电子传递）供应527.1µg/L2023东莨菪碱整合了来自酵母、细菌、植物和动物的26个蛋白质160mg/L2021典型人工酿酒酵母细胞工厂示例应用与进展酿酒酵母11.2常用元件与构建工具酿酒酵母细胞工厂11.2.1常用元件11.2.2常用质粒11.2.3遗传转化方法11.2.4构建工具酿酒酵母常用元件酿酒酵母常用元件包括：启动子、终止子、选择标记等元件。启动子根据其作用方式或功能可分为组成型启动子、诱导型启动子和双向启动子。终止子是负责促进转录终止，也能提高mRNA的稳定性，增加蛋白质的积累。根据活性大小按照强、中、弱进行分类。选择性标记可以分为两种类型：互补标记和显性选择标记。酿酒酵母常用质粒酿酒酵母中的常见载体有以下几类。（1）酵母附加体质粒(yeastepisomalplasmid,pYE)。附加体是指游离于染色体之外的独立复制DNA分子。pYE载体由大肠杆菌复制子和抗性基因、酵母2μ复制子和选择标记组成（图11-2）。由于2μ质粒内含自主复制起点(ori)和使质粒在酵母细胞中稳定存在的STB区，这类载体在酵母细胞中独立于染色体而存在。（2）酵母整合型质粒(yeastintegratingplasmid，pYI)。pYI载体由大肠杆菌复制子和抗性基因、酵母染色体DNA片段组成，通过同源重组，整合进入宿主染色体中，从而随宿主染色体一起复制。（3）酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)，是由酵母染色体中分离出来的DNA复制起始序列(ARS)、着丝点(CEN)、端粒(TEL)以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体，可承载250~400kb的DNA。YAC载体通常以双链环状DNA的形式在大肠杆菌中复制，然后用限制酶消化成线性分子。酿酒酵母遗传转化方法酿酒酵母的遗传转化方法主要有醋酸锂转化法。醋酸锂转化法是利用化学试剂如用0.1M醋酸锂溶液处理提高细胞膜的通透性，使细胞处于感受状态，然后用50%PEG3350溶液配制转化体系。具体的操作步骤为先从培养平板上挑取单酵母菌落至YPD培养基中，过夜培养；将培养物转接至新鲜培养基中，初始OD600=0.05，培养4-5h；离心收集菌体，加入1mL0.1M醋酸锂溶液重悬，离心再收集菌体，该步骤重复2次后将菌体置于冰上；将ssDNA置于99℃金属浴中处理10min，然后迅速置于冰上；配制转化体系，向无菌离心管中依次加入50%PEG3350溶液240μL、1M醋酸锂溶液36μL、待转化DNA片段或质粒共75μL、处理过的ssDNA10μL；将体系与菌体混合均匀后置于30℃培养箱中静置30min；将体系于42℃水浴锅中热激20-25min，然后离心收集菌体，按需求涂布到相应固体培养平板上，于30℃培养72h。构建工具酿酒酵母酿酒酵母分子构建主要包括：基因的整合和敲除基因整合：酿酒酵母较易发生同源重组，使用同源序列作为整合载体的同源重组位点，就可实现基因的染色体整合表达。只要有50bp以上长的同源臂，就可以准确、有效地进行同源重组。基因敲除：1）Cre-loxP系统；2）利用同源重组，构建带有“hisg—ura3—hisg”的质粒，长引物PCR制备敲除元件；构建工具酿酒酵母酿酒酵母构建工具主要包括：基因编辑技术和基因组重排技术基因编辑技术：使用CRISPR/Cas9基因编辑工具，在酿酒酵母中主要发生同源重组，设计构建sgRNA是关键。对于基因敲除，则在敲除区域上下游各选择500bp作为同源臂；对于基因整合，则在sgRNA切口处上下游各选择50bp同源重组臂序列；构建敲除或整合片段，共转染Cas9质粒，在相应的筛选压力下筛选和验证酵母单克隆。基因组重排技术：化学合成的酵母染色体内预设了“基于loxP位点特异性重组的合成型基因组重排系统(SCRaMbLE)”，利用Cre-loxP位点特异性重组机制，进行单基因区段缺失、复制、易位等基因组重排。通过基因组重排系统可以使酵母菌株实现快速进化，得到在医药、能源、环境、农业、工业等领域有重要应用潜力的菌株。11.3纤维素乙醇细胞工厂酿酒酵母细胞工厂11.3.1理化性质及应用11.3.2细胞工厂的设计11.3.3细胞工厂的构建11.3.4发酵工艺优化理化性质及应用【11.3.1】纤维素乙醇细胞工厂乙醇（ethanol）是一种有机化合物，分子式为C2H6O，CAS号为64-17-5，分子量为46.07。纤维素乙醇是具有发展前景的绿色能源，其原料木质纤维素可再生，不受地域限制，可大量获取，广泛分布于自然界中。全世界都在进行广泛的研究以加强生物燃料的合成，同时降低生物燃料行业的生产成本。乙醇的化学结构细胞工厂的设计【11.3.2】纤维素乙醇细胞工厂酿酒酵母能利用己糖如葡萄糖，通过糖酵解途径生成乙醇但不能利用占木质纤维素含量10-25%的木糖等戊糖。为了利用木糖等戊糖，需要引入新的戊糖代谢途径。木酮糖可被木酮糖激酶(Xk)磷酸化为5-磷酸木酮糖，从而进入戊糖磷酸途径。因此设计木糖到木酮糖的代谢途径，使用木糖异构酶(Xi)可将木糖转化为木酮糖，即可实现酿酒酵母利用木糖。细胞工厂的构建【11.3.3】纤维素乙醇细胞工厂表达普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)来源的木糖异构酶基因(XI)，在91h能够产生13.6g/L乙醇。对XI密码子优化、突变和高拷贝表达，也是有效策略。表达木糖代谢酵母(Scheffersomycesstipites)来源的木糖还原酶基因XR和木糖醇脱氢酶基因XDH，由于Xr对辅助因子NADPH/NADP+的偏好和Xdh对NAD+/NADH的偏好，导致氧化还原失衡，积累大量的中间代谢物D-木糖醇，降低乙醇产量，需要增加NADPH池。通过蛋白质工程，获得辅因子偏好的突变体XrR276H，减少副产物木糖醇形成。细胞工厂的构建【11.3.3】纤维素乙醇细胞工厂新兴的人工基因组重排技术在酵母底盘细胞构建、菌株耐受性提升方面也展现了巨大的发展潜力。通过人工基因组重排，使基因区域YJL154CYJL140W的删除使菌株耐受42℃高温，缺失了YER161C提高了耐受碱（pH8.0）的环境。应用人工基因组重排技术有望于提升酿酒酵母对高浓度抑制剂的耐受性，并结合转录组学分析等手段帮助探究内在的影响机制，在纤维素乙醇的工业生产上得到应用。发酵工艺优化【11.3.4】纤维素乙醇细胞工厂从生物质到乙醇的转化过程可采用分批、补料分批或连续发酵，其中搅拌罐中的补料分批模式是行业中最常用的，并优化糖化和发酵工艺，提高乙醇产量并降低生产成本。11.4香茅醇细胞工厂酿酒酵母细胞工厂11.4.1理化性质及应用11.4.2细胞工厂的设计11.4.3细胞工厂的构建11.4.4发酵工艺优化理化性质及应用香茅醇细胞工厂香茅醇（Citronellol）是一种无环单萜醇，分子式为C10H20O，CAS号为106-22-9，分子量为156.26。广泛用作化妆品和家用清洁剂的香料成分，也可作为手性化合物全合成的原料。目前香茅醇主要通过化学合成和植物提取的方法生产，但这些方法增加了环境和能源问题。从低成本和可持续的碳源出发，利用酿酒酵母合成香茅醇，成为香茅醇产业的一种经济高效且环保的替代方法。香茅醇的化学结构细胞工厂的设计香茅醇细胞工厂酿酒酵母具有内源的MVA途径，为单萜合成提供前体GPP，但合成香茅醇需要设计异源途径。从乙酰辅酶Ａ到香茅醇的代谢途径可分为３个模块，甲羟戊酸模块、IPP和DMAPP模块、香茅醇模块。细胞工厂的构建香茅醇细胞工厂在筛选最优香叶醇还原酶基因的基础上，采用“推-拉-抑制”策略，构建香茅醇酿酒酵母细胞工厂1.还原酶基因的选择以香叶醇为底物，对2种内源还原酶（Oye2、Oye3）和四种植物来源的异源还原酶-环烯醚萜合酶(CrIs、NmIs2、OeIs和AaDbr2）进行表达筛选，其中CrIs显示出最好的合成能力，香茅醇合成最高。细胞工厂的构建香茅醇细胞工厂2.推动前体供给Hmg是膜结合酶，其N端被锚定在膜上，C端具有酶活。采用截短策略，除去Hmg的N端膜结合序列（简称tHmg），使酶在细胞质中起催化功能。GAL启动子能够解耦细胞生长和产物生物合成，减轻单萜对酿酒酵母的毒性。采用GAL启动子过表达tHMGR

和IDI，强化甲羟戊酸模块，增加前体IPP和DMAPP供应量。香茅醇细胞工厂3.拉动代谢通量采用融合表达策略，构建融合蛋白拉近tCrGes与底物GPP的距离，增强了香茅醇合成能力。4.抑制竞争途径使用Erg20突变体，削弱FPP合成活性，可使更多GPP转化香茅醇。敲除了ATF1基因座，可阻断香叶醇和香茅醇的乙酰化反应，提高香茅醇积累量。细胞工厂的构建发酵工艺优化香茅醇细胞工厂香茅醇细胞工厂中，采用两相发酵，有机相为肉豆蔻酸异丙酯。恒温30℃，用NaOH调控pH5.8，溶解氧维持40%。发酵过程分为细胞生长阶段和香茅醇生产阶段。在第一阶段，以葡萄糖作为碳源，主要是生物量的快速积累。初始葡萄糖消耗后，流加葡萄糖，维持浓度低于0.1%。进入稳定期后，将碳源切换为乙醇，补料流加乙醇，维持浓度低于1%，香茅醇大量合成和积累。随着香茅醇不增加，产能最大时，及时结束发酵。11.5二氢青蒿酸细胞工厂酿酒酵母细胞工厂11.5.1理化性质及应用11.5.2细胞工厂的设计11.5.3细胞工厂的构建11.5.4发酵工艺优化理化性质及应用二氢青蒿酸细胞工厂二氢青蒿酸的化学结构二氢青蒿酸可用于合成青蒿素及其衍生物，是治疗疟疾的化学药物。目前青蒿素是从黄花蒿中提取，再化学半合成蒿甲醚、蒿琥酯等原料药，生产临床用抗疟疾的复方药物。通过设计构建二氢青蒿酸酿酒酵母细胞工厂，发酵生产二氢青蒿酸中间体，有重大应用前景。细胞工厂的设计二氢青蒿酸细胞工厂二氢青蒿酸的生物合成途径二氢青蒿酸是倍半萜类，其生物合成属于类异戊二烯途径。根据主要中间代谢物和终产物，二氢青蒿酸的生物合成途径可分解为3个模块，分别是青蒿二烯模块、青蒿酸模块和二氢青蒿酸模块细胞工厂的构建二氢青蒿酸细胞工厂青蒿二烯合成模块问题：在酿酒酵母中，青蒿二烯模块包括从乙酰辅酶A到青蒿二烯，在本模块中，Hmg是途径的限速酶，其次Ads的特性不强，主产物青蒿二烯约占80%-90%，青蒿二烯的异构体占10%-15%，同时还生成其他倍半萜副产物例如β-法尼烯、γ-葎草烯、双酚烷等。解决措施：为了增加青蒿二烯的前体FPP的代谢通量，使用诱导型强启动子PGAL1、PGAL10过表达了从乙酰-CoA到FPP途径之间的所有基因（包括ERG10、ERG13、tHMGR1、ERG8、ERG19、ERG12、IDI1和ERG20），其中染色体整合过表达了3拷贝tHMGR1，构建高产青蒿二烯的底盘细胞。敲除GAL1、GAL7和GAL10三个基因，防止发酵过程中诱导物质半乳糖被代谢，降低诱导效应，使半乳糖仅作为基因开启的诱导物质，而不是碳源。其次，用2μ质粒进行多拷贝表达ADS，打通酿酒酵母从糖到青蒿二烯的合成途径。细胞工厂的构建二氢青蒿酸细胞工厂青蒿酸合成模块问题：青蒿酸模块包括从青蒿二烯到青蒿酸。CYP71AV1氧化青蒿二烯生成青蒿醇，被Adh1氧化为青蒿醛，被Aldh1催化脱氢反应，生成青蒿酸。CYP71AV1是P450氧化酶，需要电子供体Cpr蛋白，是限速步骤（转化速率通常在每分钟几十到几百之间）。解决措施用强启动子PGAL10控制表达Cyp71AV1基因；过表达酿酒酵母内源血红素合成相关的关键基因HEM1和抵抗活性氧的基因CTT1，以提高CYP71AV1的催化活性；将CYP71AV1的N端膜定位区的前15个氨基酸替换为牛来源的17-α细胞色素P450羟化酶的N端8RP序列，以优化在酿酒酵母中表达；将AaCpr1、AaCyb5基因整合到基因组上，以辅助CYP71AV1更好地发挥作用；在基因组上整合表达AaADH1和AaALDH1基因，以促进青蒿酸的合成。细胞工厂的构建二氢青蒿酸细胞工厂二氢青蒿酸合成模块问题：二氢青蒿酸模块包括从青蒿醛到二氢青蒿醛再到二氢青蒿酸，或者青蒿酸直接到二氢青蒿酸。Dbr2催化青蒿醛生成二氢青蒿醛，被Aldh1氧化生成二氢青蒿酸。由于Aldh1能催化青蒿醛生成副产物青蒿酸，大量表达DBR2基因，减少代谢流流入青蒿酸。解决措施：为了扭转Dbr2对青蒿醛反应的劣势，可通过刚性非螺旋linker（APAPAPAPAPAPAPAP）将AaAdh1和Dbr2进行融合表达，形成从青蒿醇到二氢青蒿醛的底物通道。当青蒿醇被融合蛋白Dbr2-AaAdh1脱氢生成青蒿醛时，由于Dbr2在空间上比AaAldh1更加临近，优先与青蒿醛发生反应生成二氢青蒿醛，二氢青蒿醛与游离出融合蛋白空间外的青蒿醛竞争AaALDH1，进一步抑制青蒿酸的生成并促进二氢青蒿酸的生成。发酵工艺优化二氢青蒿酸细胞工厂发酵工艺：以葡萄糖为初始碳源，氢氧化钠/氨水混合物调节pH5.0，30℃，搅拌发酵，溶氧设定值为40-50%。初始糖耗完后，用葡萄糖流加补料，用于细胞生长。进入生产期，加入有机相十四酸异丙酯，流加乙醇补料，适时结束发酵。11.6长春碱细胞工厂酿酒酵母细胞工厂11.6.1理化性质及应用11.6.2细胞工厂的设计11.6.3细胞工厂的构建11.6.4发酵工艺优化理化性质及应用长春碱细胞工厂

长春碱（Vinblastine），CAS号为865-21-4，分子式为C46H58N4O9，分子量为810.97。长春碱属于萜类吲哚生物碱类，是一种强效的细胞分裂抑制剂，通常与其他药物联合使用，用于治疗多种癌症，包括霍奇金淋巴瘤等。长春碱是世界卫生组织基本药物之一，目前主要从植物中提取纯化前体文多灵和长春质碱，化学偶联半合成长春碱。细胞工厂的设计长春碱细胞工厂细胞工厂的设计长春碱细胞工厂

长春碱生物合成途径最早于长春花中发现，生物合成长春碱需要31步的途径。长春花碱途径很复杂，在长春花植株中路径酶定位到了至少5种细胞器中，即细胞质、质体（GES），内质网（细胞色素P450及其还原酶），细胞核（SGD），液泡（STR），涉及到多种细胞类型与组织。考虑到基因编辑工具的可用性、内膜系统的存在，酿酒酵母是适宜的合成长春碱的细胞工厂。根据主要中间代谢物和终产物，长春碱的生物合成途径可分解为3个模块，分别是异胡豆苷（Strictosidine）模块，生产它勃宁（Tabersonine）和长春质碱（Catharanthine）的模块，以及生产文多灵（Vindoline）的模块。细胞工厂的设计长春碱细胞工厂，，，，，，

异胡豆苷（Strictosidine）模块包括从香叶醇到异胡豆苷（图11-19），其中包括香叶醇8-羟化酶（Geraniol8-hydroxylase，简称G8H）,8-羟基香叶醇氧化还原酶（8-Hydroxygeranioloxidoreductase，简称8HGO）,环烯醚萜合酶（Iridoidsynthase,简称ISY）,环烯醚萜氧化酶（Iridoidoxidase，简称IO）,乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase2，简称CYPADH）,环烯醚萜葡萄糖基转移酶（7-Deoxyloganeticacidglucosyltransferase，简称7DLGT）,7-脱氧马钱酸羟化酶（7-Deoxyloganicacidhydroxylase，简称7DLH）,马钱子苷酸O-甲基转移酶（LoganicacidO-methyltransferase，简称LAMT）,断马钱子苷合酶（Secologaninsynthase，简称SLS)，异胡豆苷合酶（Strictosidinesynthase,简称STR），色氨酸脱羧酶（Tryptophandecarboxylase，简称TDC）。香叶醇之前的途径参见11-4部分。

异胡豆苷是长春花TIA生物合成中重要的中间产物,是形成多种TIA的关键前体物质,所以STR是长春花TIA整个代谢合成途径中最为重要的一个关键酶。此外每个模块包括细胞色素P450还原酶(CPR)的表达作为细胞色素b5(CYB5)支持细胞色素P450酶。细胞工厂的设计长春碱细胞工厂细胞工厂的设计长春碱细胞工厂

它勃宁（Tabersonine）和长春质碱（Catharanthine）的模块包括从异胡豆苷到它勃宁、长春质碱的10步酶反应，涉及10个基因（图11-20），分别是异胡豆苷葡萄糖苷酶（Strictosidineβ-d-glucosidase，简称SGD），缝籽木蓁合酶（Geissoschizinesynthase，简称GS），缝籽木蓁氧化酶（Geissoschizineoxidase，简称GO），肉桂醇脱氢酶样酶1/2（Cinnamylalcoholdehydrogenase-likeenzyme1/2，简称Redox1/2），花冠木碱-O-乙酰转移酶（Stemmadenine-O-acetyltransferase，简称SAT），前二酮乙酸合酶（Precondylocarpineacetatesynthase，简称PAS），二氢前骨节心蛤碱乙酸合酶（Dehydroprecondylocarpineacetatesynthase，简称DPAS）它勃宁合酶（Tabersoninesynthase，简称TS），长春质碱合酶（Catharanthinesynthase，简称CS）。细胞工厂的设计长春碱细胞工厂细胞工厂的设计长春碱细胞工厂T3OAc-CoACoA文多灵（Vindoline）模块包括从它勃宁到文多灵的6步连续反应（图11-21），是产生双吲哚类生物碱的限速步骤。首先它勃宁在它勃宁羟化酶（Tabersonine16-hydroxylase2,简称T16H）的酶促作用下进行芳烃羟化，生成16-羟基它勃宁（16-Hydroxytabersonine）。16-羟基它勃宁在甲基氧化酶（16O-methyltransferase,简称16OMT）的作用下生成16-甲氧基它勃宁（16-Methoxytabersonine）。通过它勃宁3-加氧酶（Tabersonine3-oxygenase,简称T3O）和它勃宁3-还原酶（Tabersonine3-reductase,T3R）的协同作用将16-甲氧基它勃宁转化为16-甲氧基-2,3-二氢-3-羟基它勃宁（16-Methoxy-2,3-dihydro-3-hydroxytabersonine）。随后在N-甲基转移酶（N-Methyltransferase,简称NMT）的催化作用下生成脱乙酰氧基文多灵（Desacetoxyvindoline），在脱乙酰氧基文多灵羟化酶（Desacetoxyvindoline-4-hydroxylase，简称D4H）的作用下生成脱乙酰文多灵（Deacetylvindoline）。最后在脱乙酰文多灵-4-O-乙酰转移酶（Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase，简称DAT）的作用下，生成文多灵。文多灵和长春质碱可以使用过氧化物酶PRX1和过氧化物进行酶促偶联，或使用Fe(III)2进行化学偶联，或在黄素单核苷酸存在下使用近紫外辐射进行光化学偶联后可生成长春碱。相比酶促偶联，化学偶联法更有利于长春碱的生产。细胞工厂的设计长春碱细胞工厂在酿酒酵母中重构长春碱的合成途径时，以模块化方式将整个生物合成通路进行组合。通过组合代谢途径工程提高长春质碱的产量，包括基因过表达以消除代谢通量的瓶颈，选择合适的高活性植物酶和/或特异性信号肽工程用于正确定位关键通路酶，蛋白融合表达促进底物运输和去除竞争性代谢途径。首先使用葡萄糖依赖性PHXT1和PHXT3启动子动态下调ERG9和ERG20，ERG20WW与截短的GES（tGES）融合增加前体香叶醇供应。进一步过表达由AgrGPPS2编码的特定GPP合酶，同时删除路径中的编码醇乙酰转移酶的ATF1基因和编码还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化还原酶OYE2基因，以尽量减少前体香叶醇的副产物乙酸香叶