人工细胞工厂设计构建 课件 第15章 天然产物混菌细胞工厂

第15章天然产物混菌细胞工厂15.1概述15.2水飞蓟宾和异水飞蓟宾混菌细胞工厂15.3氧化紫杉烷混菌细胞工厂15.4红景天苷混菌细胞工厂15.5本章小结天然产物混菌细胞工厂15.1概述概述天然产物混菌细胞工厂15.1.1混菌合成天然产物的优势与挑战15.1.2天然产物混菌细胞工厂研究进展天然产物结构功能多样，在食品、医药、化妆品等领域应用广泛紫杉醇红景天苷水飞蓟宾白藜芦醇生物碱植物提取原料受限耕地依赖周期长含量低步骤繁琐污染环境收率低成本高化学合成15.1.1混菌合成天然产物的优势与挑战许多天然产物化学结构复杂、生物合成途经长，在单菌中往往难以实现高效合成。Smolkeet.al,Nature2020Parket.al,BiotechnolBioeng202211步外源反应酿酒酵母大肠杆菌13步外源反应细胞工厂效率低长合成途径代谢流分配少多前体平衡难难点15.1.1混菌合成天然产物的优势与挑战劳动分工，减轻代谢负担

模块拆分，便于组合优化

代谢分区，提供适宜的酶表达环境混菌培养是实现长途径天然产物高效合成的重要方式。

菌群比例稳定性差，

缺乏自主调控能力，难以工业应用单菌培养混菌培养优势：挑战：15.1.1混菌合成天然产物的优势与挑战15.2天然产物混菌细胞工厂研究进展15.2水飞蓟宾和异水飞蓟宾混菌细胞工厂天然产物混菌细胞工厂15.2.1理化性质及应用15.2.2水飞蓟宾和异水飞蓟宾的生物合成途径15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建15.2.4三大肠杆菌细胞工厂的设计与构建

15.2.1理化性质及应用水飞蓟宾异水飞蓟宾

黄酮木质素类化合物

保肝护肝药物水飞蓟素的主要活性成分。

难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于氯仿，分子量为482.44。

目前的生产方法是从菊科植物水飞蓟干燥果实中提取，

受季节、气候及品种限制，

存在产量、质量不稳定等问题。15.2.2水飞蓟宾和异水飞蓟宾的生物合成途径水飞蓟宾/异水飞蓟宾的生物合成途径长、多前体平衡难，采用模块化设计，将途径划分为四个模块咖啡酸模块、松柏醇模块、黄杉素模块、水飞蓟宾/异水飞蓟宾模块15.2.2水飞蓟宾和异水飞蓟宾的生物合成途径咖啡酸模块松柏醇模块黄杉素模块和水飞蓟宾/

异水飞蓟宾模块15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建为减少对碳源的竞争，设计以葡萄糖和甘油为碳源的双大肠杆菌底盘细胞工厂

甘油利用菌株：敲除丙酮酸激酶基因pykA和pykF及葡萄糖转运相关基因ptsG、manXYZ和glk

葡萄糖利用菌株：敲除甘油激酶基因glpK15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建为提高稳定性，设计构建基于多代谢物互利共生的共培养体系

氨基酸合成和TCA循环对细胞生长至关重要。

甘油利用菌株：敲除ppc，导致TCA循环缺陷

葡萄糖利用菌株：敲除gdhA和gltBD，导致氨基酸合成缺陷菌群比例表现出良好稳定性15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建双菌共培养合成前体松柏醇下游菌株占比低，转化能力不足，导致中间体咖啡酸积累解决方案：设计响应咖啡酸的传感器，自主调节菌群比例15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建儿茶酚生物传感器DmpR可响应咖啡酸双菌共培养合成前体松柏醇难点：响应咖啡酸的传感器未见报道基于结构相似性筛选NahR生物传感器DmpR生物传感器ACSSyntheticBiology,2014,3(12):1011-1014.咖啡酸对咖啡酸无响应对咖啡酸有响应15.2.3双大肠杆菌底盘细胞的设计与构建自主调控菌株比例，解决了中间体积累问题双菌共培养合成前体松柏醇利用咖啡酸传感器调控下游菌株谷氨酸合成，进而调节细胞生长谷氨酸合成基因15.2.4三大肠杆菌底盘细胞的设计与构建双菌合成仅产生少量水飞蓟宾/异水飞蓟宾为了减轻代谢负担和竞争，由咖啡酸菌株、松柏醇菌株、水飞蓟宾菌株（含黄杉素模块和水飞蓟宾模块）组成三大肠杆菌细胞工厂三菌共培养，中间代谢物咖啡酸和松柏醇积累很少，菌群比例根据中间体咖啡酸浓度自主调整至2:1:7，水飞蓟素较双菌共培养提高8倍。15.3氧化紫杉烷混菌细胞工厂天然产物混菌细胞工厂15.3.1理化性质及应用15.3.2氧化紫杉烷的生物合成途径15.3.3大肠杆菌-酿酒酵母细胞工厂的设计构建15.3.4大肠杆菌-酿酒酵母细胞工厂的发酵优化

15.3.1理化性质及应用紫杉醇四环二萜白色结晶性粉末，难溶于水，分子量853.91用于治疗乳腺癌、卵巢癌等。紫杉醇最初是从红豆杉的树皮中发现的，但含量极低，提取纯化工艺繁琐。目前主要通过化学半合成生产。15.3.2氧化紫杉烷的生物合成途径TS：截短型紫杉二烯合成酶；5α-CYP：紫二烯5α-羟化酶；TAT：5α-羟基-紫杉二烯乙酰基转移酶；10β-CYP：紫杉烷10β-羟化酶；CPR，还原酶紫杉醇的生物合成起始于二萜共同前体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）大肠杆菌：具有萜类合成途径，适合于表达紫杉二烯合成酶，

可高效合成紫杉醇的骨架紫杉二烯。酿酒酵母：具有丰富的细胞内膜结构，

是表达紫杉二烯氧化酶等细胞色素P450酶的理想宿主。15.3.3大肠杆菌-酿酒酵母细胞工厂的设计构建大肠杆菌：表达异戊烯基焦磷酸合成模块（dxs、idi和ispDF）和紫杉二烯合成模块GGPPS和tTS（截去膜靶向信号肽序列）；通过多变量模块优化产量达到克级。酿酒酵母：使用UAS-GPDp启动子和CYCt终止子，融合表达5α-CYP-CPR以及10β-CYP-CPR，构建5α-乙酰氧基-10β-羟基紫杉二烯酿酒酵母细胞工厂。15.3.4大肠杆菌-酿酒酵母细胞工厂的发酵优化大肠杆菌酿酒酵母木糖X紫杉二烯乙酸大肠杆菌代谢木糖，产生的乙酸为酿酒酵母提供碳源，从而建立互利共生关系。通过优化，将酿酒酵母与大肠杆菌的接种比例设定为40:1。酿酒酵母的生长受到大肠产生的乙酸浓度的限制，不会过度增殖。酿酒酵母和大肠杆菌的平衡比例约为1:2，减少了途径中间体紫杉二烯积累，增加了氧化紫杉烷产量。15.4红景天苷混菌细胞工厂天然产物混菌细胞工厂15.4.1理化性质及应用15.4.2双大肠杆菌细胞工厂的设计15.4.3双大肠杆菌细胞工厂的构建15.4.4双大肠杆菌细胞工厂的发酵15.4.1理化性质及应用红景天苷酪醇8-O-β-D-葡萄糖苷分子量为300.3，溶于乙醇，易溶于甲醇，极易溶于水是珍稀中药材红景天的活性成分，广泛用于治疗或预防脑缺血、疲劳和神经退行性疾病。我国年消费天然野生红景天药材约7000吨，为了摆脱对珍稀资源红景天的高度依赖性，

亟需开发红景天苷的微生物高效合成技术。15.4.2双大肠杆菌细胞工厂的设计KDC：酮酸脱羧酶；Adh,醇脱氢酶；UGT85A1，糖基转移酶红景天苷的生物合成途径15.4.3双大肠杆菌细胞工厂的设计以酪醇为代谢节点，将合成途径分为酪醇模块和红景天苷模块基于劳动分工原则，由酪醇菌株和红景天苷菌株组成红景天苷混菌细胞工厂为了提高混菌体系的稳定性，设计酪醇菌株为苯丙氨酸缺陷型，红景天苷菌株为酪氨酸缺陷型，通过酪氨酸和苯丙氨酸的交叉互养，建立菌株间的互利共生关系为避免混菌对碳源的竞争，设计酪醇菌株优先利用木糖，红景天苷菌株选择性利用葡萄糖15.4.3双大肠杆菌细胞工厂的构建酪醇合成途径的编码基因筛选和构建酪醇底盘细胞的构建红景天苷合成基因筛选和糖基化底盘细胞构建互养混菌细胞工厂的构建混糖碳源利用的混菌细胞工厂的构建BLAST筛选获得毕赤酵母GS115中酮酸脱羧酶KDC4具有高活性过表达aroGfbr-tyrAfbr-aroE模块，敲除

ptsG，pykA，pykF，tyrR，pheA，feaB组成型trc启动子替换诱导型T7启动子筛选糖基转移酶获得特异性酶UGT85A1表达pgm、galU，敲除ushA，增加UDP-葡萄糖供应分别利用葡萄糖和木糖，减少生长竞争15.4.4双大肠杆菌细胞工厂的发酵优化葡萄糖/木糖比例优化混菌的初始接种比例5L生物反应器中发酵放大比例为4/1时，红景天苷产量最高1/2时红景天苷产量最高，仅有少量酪醇积累初始接种比1/2，补料中葡萄糖/木糖比例为4/1发酵罐种群比例变化与摇瓶中相似，生产阶段比值保持在1:1左右培养129h红景天苷产量最大摇瓶发酵发酵放大MetabolicEngineering2018,