DB41∕T 1727-2018 饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法

ICS65.120DB41河南省质量技术监督局发布DB41/T1727—2018本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、河南省兽药饲料监察所。本标准主要起草人:兰尊海、单慧燕、易善平、文英会、陈晓鸽、薛宁、许亚楠、李培娜、孙世雯。DB41/T1727—20181饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法本标准规定了饲料中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸和色氨酸共18种氨基酸的测定方法。本标准适用于饲料原料和饲料中氨基酸含量的测定。酸水解法适用于除色氨酸外其它氨基酸的测定；碱水解法只适用于色氨酸的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18246饲料中氨基酸的测定3原理蛋白质在盐酸或氢氧化钠的作用下，水解成单一氨基酸，水解后的氨基酸与衍生试剂反应，形成稳定的黄色衍生物，经C18色谱柱分离，紫外检测器检测，与氨基酸标准峰比较，按外标法计算各氨基酸的含量。4试剂和材料4.1试剂4.1.1盐酸（HCL）:浓度≥36%，优级纯。4.1.2氢氧化钠（NaOH）:优级纯。4.1.3乙腈（C2H3N）:色谱纯。4.1.4碳酸氢钠（NaHCO3）。4.1.5无水乙酸钠（C2H3NaO2）。4.1.6磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.1.7N,N-二甲基甲酰胺（C3H7NO）:色谱纯。4.1.8冰乙酸（CH3COOH）。4.2试剂配制4.2.1盐酸溶液（6mol/L）:取500mL盐酸加水稀释至1000mL，混匀。4.2.2氢氧化钠溶液（5mol/L）:称取200g氢氧化钠，溶于200mL水中，冷却至室温后，用水稀释至1000mL，混匀。DB41/T1727—201824.2.3平衡缓冲溶液（pH7.0）:称取3.4g磷酸二氢钾加入145.5mL0.1mol/L的氢氧化钠溶液，用水稀释至500mL，混匀，抽滤，贮存于棕色瓶中。4.2.4衍生试剂（1%）:称取1g氟苯，用乙腈溶解稀释至100mL，混匀。4.2.5衍生缓冲液（pH9.0）:称取21.0g碳酸氢钠加入470mL水溶解过滤，加入30mL乙腈于500mL试剂瓶中。4.2.6流动相（0.05mol/L）:称取4.1g无水乙酸钠，加入100mLN，N-二甲基甲酰胺定容至1000mL容量瓶中，用20%冰乙酸调节pH至6.4，备用。4.3标准品4.3.1混合氨基酸标准溶液:经国家认证并授予标准物质证书的标准溶液。4.3.218种单个氨基酸标准品:固体，纯度≥98%。4.4标准品配制4.4.1混合氨基酸标准工作液（100μg/mL）:购买市售的氨基酸标准溶液。4.4.2L-色氨酸标准工作液（100μg/mL）:准确称取L-色氨酸标准品约10.00mg，溶于少许水和数滴0.1molL氢氧化钠溶液中，冷却至室温，用水稀释至100mL，混匀，为标准上机液。5仪器和设备5.1实验室用粉碎机。5.2样品筛:孔径0.25mm。5.3分析天平:感量为0.1mg。5.4电热鼓风干燥箱。5.5真空泵。5.7快速混匀器。5.8高效液相色谱仪:附紫外检测器、二元泵或四元泵、柱温箱。6分析步骤6.1试样制备取具代表性的饲料样品，用四分法缩分取250g左右，粉碎并过筛0.25mm孔径（40目）筛，充分混匀后装入样品瓶（或袋）中备用。6.2试样水解酸水解法:称取0.1g～0.5g试样（准确至0.0001g）于φ1.8cm×20cm水解管中，加10mL盐酸溶液（4.2.1）后,按照GB/T18246—2000中3.1进行酸水解处理。打开水解管，将水解液过滤至50mL容量瓶中，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一容量瓶中，最后用水定容至刻度，振荡混匀。碱水解法:称取0.4g～0.6g饲料试样（准确至0.0001g）于φ1.8cm×20cm水解管中，加10mL氢氧化钠溶液（4.2.2）后，按照GB/T18246—2000中3.2进行碱水解处理。DB41/T1727—20183打开水解管，先用10mL的盐酸溶液（4.2.1）转移至50mL容量瓶中，用少量水多次冲洗水解管，水解液移入同一容量瓶内，最后用水定容至刻度，振荡混匀。6.3试样衍生准确移取样品溶液和标准溶液各10μL于小试管中，抽干，准确加入衍生缓冲液20μL，用快速混匀器混匀，再加衍生试剂20μL，混匀，封口膜封口，放入电热鼓风干燥箱中60℃衍生30min，取出放至室温，加平衡缓冲液160μL，混匀。6.4色谱条件6.4.1二元或四元泵高效液相色谱仪。6.4.2紫外检测器。6.4.3柱温箱。6.4.4手动或自动进样器。6.4.5色谱柱:C18柱（内径:4.6mm，长:250mm，粒径5μm）。6.4.6流动相:A-0.05mol/L乙酸钠溶液；B-乙腈:水=1:1。洗脱梯度见表1。序号时间，minA%B%10.084.020.384.034.069.031.049.564.036.0545.055.0628.040.060.0734.00.0838.00.0939.084.046.084.06.4.7流速:1.20mL/min。6.4.8柱温:25℃。6.4.9检测波长:360nm。6.4.10进样量:10μL。6.5试样的测定混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入高效液相色谱仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的含量。7分析结果的表述7.1样品中氨基酸含量的计算样品测定液氨基酸的含量按下列公式计算:4式中:X1——试样中各氨基酸的含量，%；Pi——试样溶液的峰面积；Cs标准溶液的浓度，μg/mL；V——试样溶液的稀释倍数；Vs——标准溶液进样体积，μL；Ps——标准溶液的峰面积；m——试样质量，g；Vi——试样溶液的进样体积，μL。7.2结果表示以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留至小数点后两位。8精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差不得超过4%。9其他样品中各氨基酸的检出限和定量限见表2。表2样品中各氨基酸的检出限和定量限氨基酸名称检出限/(mg/kg)定量限/(mg/kg)氨基酸名称检出限/(mg/kg)定量限/(mg/kg)天门冬氨酸0.040.21蛋氨酸0.050.23谷氨酸0.050.23胱氨酸0.