第10章 植物微观表型测量技术

植物微观表型测量技术HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY1目录CONTENTS第一节微观表型简介第二节植物叶片气孔表型测量技术第三节植物叶片气孔表型参数测量方法第四节叶片气孔表型在生物学中的应用2一、微观表型简介微观表型定义微观图像无损成像设备植物微观表型是指在植物组织和细胞尺度上可观察到且在特定时间由基因型表达出来的物理、化学或生物性状。植物从冠层到器官的不同层次上捕获外部环境信号，通过能量和质量交换以及细胞和组织水平上的传输，转化为内部环境信号，再通过细胞器水平上的信号转导途径导入并被进一步放大，最终通过表观遗传修饰影响基因表达（图10-1）。微观表型作为连接外部环境因子和内部环境信号的重要界面，对理解基因表达与复杂宏观表型形成之间的关系发挥着关键作用。图10-1植物微观表型示意图3微观表型定义微观图像无损成像设备微观图像采集方法包括有损取样如切片和无损两种。组织和细胞尺度的无损成像设备主要有以下5种。激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）激光烧蚀断层扫描（LAT）X射线微断层摄影技术（Micro-CT）核磁共振成像（Magneticresonanceimaging，MRI）显微高光谱成像（Micro-hyperspectralimaging，MHSI）4一、微观表型简介二、植物叶片气孔表型测量技术气孔简介气孔分类方法影响叶片气孔表型的主要环境因素5气孔是植物表皮所特有的结构，多存在于植物的地上部分，尤其是植物叶片表皮上。气孔是植物蒸腾失水的“门户”，也是植物与外界环境进行气体交换的“窗口”，在植物生长过程中起着十分重要的作用。气孔一般由一对保卫细胞围绕一个孔隙构成（图10-2），当气孔打开时，植物可以摄取进行光合作用所必需的二氧化碳，当气孔关闭时，植物可以减少水分的散失以提高抗旱能力。通过叶片气孔的打开和关闭，可使植物体内的水分与外界环境之间达到平衡，通过改变打开气孔孔隙大小来调节光合作用、呼吸作用和蒸腾作用的速率，以适应变化的环境，使植物适应不同的生长环境。图10-2气孔结构二、植物叶片气孔表型测量技术气孔简介气孔分类方法影响叶片气孔表型的主要环境因素6气孔通常存在于植物体的地上部分，尤其是在叶片的叶表皮上，在幼茎、花瓣上也可见到，但多数沉水植物则没有。叶片上气孔的数目和分布因植物不同而不同，一般叶片上表皮和下表皮都有气孔，多数植物下表皮的气孔数多于上表皮；同一植物不同的叶片，气孔分布也存在差异，一般来说，低处着生的叶片气孔比高处的大但数量较少，并且气孔密度随之从低到高；一般来说，同种植物单个叶片的气孔密度排序为叶基>叶中>叶尖，但也有例外，如禾谷类植物最高的气孔密度在叶片中部；不同的植物，其叶片上的气孔分布特征差异较大，并无统一的分布规律。二、植物叶片气孔表型测量技术7气孔的分类方法有很多种：1）根据副卫细胞的数目及排列方式，可分为：极细胞型、共环极细胞型、腋细胞型、聚腋下细胞型、无规则四细胞型、橫列型。2）根据保卫细胞内的叶绿体的数目及大小差异，可分为：大粒型、群粒型、中粒型、小粒型。3）根据气孔的保卫细胞和副卫细胞的发生来源是否相同，可分为：中源型、周源型、中周型。4）根据保卫细胞的形状、壁的加厚情况，可分为：肾状等厚壁型、球状等厚壁型、哑铃型、半月型、结节型、窗框型、流苏型、类帽型、扁担型、珠贝型、枕头型、船型、卷发型、耳垂型、锯齿型、唇状亚铃型、方框型、双气孔型。5）根据单子叶植物和双子叶植物的不同特点，单子叶植物可分为：保卫细胞由一个副卫细胞包围、保卫细胞外侧伴有一个副卫细胞、保卫细胞由一个副卫细胞包围且其中两个副卫细胞较小略成圆形位于气孔两端、气孔无任何副卫细胞包围，双子叶植物可分为：无规则型、不等型、平列型、橫列型。气孔简介气孔分类方法影响叶片气孔表型的主要环境因素二、植物叶片气孔表型测量技术外界环境变化对植物气孔表型的主要境影响因素有4种。光照光能是植物进行光合作用的驱动力，光照影响植物叶片进行光合作用的效率，在叶片气孔的形成和发育过程中起到关键的诱导和调节作用。不同植物叶片气孔对光照的响应也不一样。二氧化碳浓度叶片气孔是植物吸收大气二氧化碳和散失水分的主要门户，植物叶片通过改变气孔开口大小控制外界环境二氧化碳进入叶片的数量。8气孔简介气孔分类方法影响叶片气孔表型的主要环境因素土壤水分叶片气孔对植物的蒸腾作用和光合作用等生理过程有重要影响，与植物抗旱能力密切相关。气孔调节是植物抵御干旱胁迫和适应环境的机制之一，植物通过控制气孔数目和开闭程度调节叶片的蒸腾速率，从而影响叶片水势。温度温度是影响植物气孔性状的重要因子，但温度对气孔性状的影响尚无一致的结论。有研究发现，高温没有改变植物叶片的气孔密度，但另外有研究却显示高温能减少或增加气孔密度，高温还能改变单个气孔的大小及其在叶片上的空间分布格局。除了环境因素影响气孔的性状，快速的气孔反应速度也能使植物更好地应对不断变化的环境。三、植物叶片气孔表型参数测量方法概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数图10-3气孔表型测量流程框图植物叶片气孔表型参数测量一般包括以下步骤：植物叶片气孔图像采集、图像处理和分析、气孔表型参数测量（图10-3）图像采集方式：无损、有损图像处理和分析：对原始图像的预处理和采用深度学习神经网络识别或分割图像中的气孔主要气孔表型参数：气孔密度、气孔指数、关闭气孔大小和打开气孔孔隙大小图10-4为华中农业大学作物表型团队气孔研究小组采用两种分辨率的图像采集设备测量活体玉米叶片气孔表型参数的流程图。9三、植物叶片气孔表型参数测量方法图10-4玉米叶片气孔表型参数测量流程（Liang等，2022）10概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数三、植物叶片气孔表型参数测量方法植物叶片气孔图像采集可分为两类：离体图像采集和活体图像采集利用化学药品处理叶片表皮后将其制成载玻片，再在显微观测设备下进行图像采集优点：采集到的气孔图像清晰、平整，所有气孔处在一个平面上缺点：制作载玻片操作过程繁琐、有损、耗时耗力且不易掌握采用显微设备直接对活体植物叶片进行气孔图像采集优点：无损、快速，可通过观测气孔变化实时表达植物体生理状态，能在植物的整个生长过程中动态观察气孔变化缺点：采用显微设备采集图像时，由于叶片不平整，需要调焦以适应不同高度的叶片，有时会出现一幅图像中部分气孔模糊的现象，另外当叶片表面有灰尘和杂质时，采集到的气孔图像模糊离体图像采集活体图像采集11概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数三、植物叶片气孔表型参数测量方法（1）离体图像采集12概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数10-5植物叶片气孔离休图像采集方法植物叶片气孔离体图像采集方法大体如图10-5所示，采集方法的不同主要体现在叶片气孔制片方法的不同上。常用的气孔制片方法主要有以下4种。撕取法：用镊子从叶片上撕取叶片表皮再制片，包括直接撕取法和煮沸撕取法。刮制法：用刀片刮去一侧表皮和叶肉细胞，只留下需要观察的一侧表皮细胞制片，包括透明胶带刮制法和离析刮制法。印迹：在植物叶片表面涂抹印迹试剂，待试剂风干凝成薄膜后将薄膜取下，或直接用透明胶带粘取，取下的薄膜上就印有表皮细胞的界迹边痕和气孔的形态结构，包括透明胶带粘取法、火棉胶法、白乳胶法、指甲油法、乒乓球的丙酮溶液法、502胶印迹法、琼脂糖印迹法。离析法：主要原理是用化学试剂把细胞间的中层物质溶解，使细胞分离，从而研究细胞的立体形态结构，包括氢氧化钠离析法、次氯酸钠快速离析法、次氯酸钠离析改良法、酸解离法、蜡叶标本离析法、铬酸处理再透明胶带粘取法。三、植物叶片气孔表型参数测量方法（2）活体图像采集13概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数图10-6基恩士VHX2000(a)及其图像(b)(WenlongSong等，2020)植物叶片气孔活体图像采集方法主要有两种。图10-7便携式显微镜及其图像基恩士公司的数码显微镜：镜头的放大倍数有500~5000倍，气孔图像一般在500×和1000×镜头下采集便携式设备采集气孔图像：目前用便携式显微镜采集气孔图像主要有艾尼提显微镜和ProScopeHR2显微镜，艾尼提显微镜的放大位数为400~600倍，ProScopeHR2显微镜的放大位数为400倍。三、植物叶片气孔表型参数测量方法（1）图像预处理采用便携式显微镜采集活体植物叶片气孔时，活体植物叶片不经过任何处理，叶片比较生硬，采集时不能保证完全平整，且便携式显微镜的景深有限，所以采集到的图像中存在清晰的气孔，也有模糊的气孔；另外，有些植物叶片表面存在蜡质，采集到的图像比较模糊。因此测量气孔图像中气孔表型参数之前需对图像进行预处理，主要是去模糊处理。14概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

三、植物叶片气孔表型参数测量方法15概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

三、植物叶片气孔表型参数测量方法16概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数图10-8图像预处理效果图(a)原图；(b)去雾效果；(c)去雾+LR算法效果；(d)自适应直方图均衡化；(e)全局直方图均衡化Lucy-Richardson图像复原算法:Lucy-Rechard(LR)图像复原算法是Lucy和Richardson提出的，LR算法假设图像服从Poission分布，采用最大似然法进行估计，是一种基于贝叶斯分析的迭代算法。LR算法对模糊参数的估计具有较高精度，对运动模糊图像复原有良好的效果。图10-8c为模糊气孔图像经过去雾和LR算法后的效果。Lucy-Richardson图像复原算法的Matlab代码如下：img=imread(需要处理的图像);PSF=fspecial(‘gaussian’,5,5);Img_deconvlucy=deconvlucy(img,PSF,5);其中PSF为点扩展函数，img为去模糊之前的RGB图像

Img_deconvlucy为去模糊后的图像。三、植物叶片气孔表型参数测量方法17概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数直方图均衡化算法:直方图均衡化是一种简单有效的图像增强技术，通过改变图像的直方图来改变图像中各像素的灰度，主要用于增强动态范围偏小的图像的对比度。主要有局部均衡化和全局均衡化两种方法。全局均衡化是对图像整体做均衡化处理，放大图像信息量多的灰度区域，提升图像的视觉效果。该方法比较简单，但局部细节效果不明显，且由于整体亮度的提升，也会使局部图像的细节变得模糊（图10-8e所示）。局部均衡化是将均衡化算法分散到图像的局部区域，然后通过局部的运算获得所需的增强效果，适用在深度信息变化复杂而对比度不高的气孔图像处理，但该算法会加大噪声对图像的影响。局部均衡化算法有自适应均衡化（如图10-8d所示）和限制对比度自适应均衡化两种。三、植物叶片气孔表型参数测量方法18概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数用python+opencv2实现全局直方图均衡化和自适应直方图均衡化的代码如下：img=cv2.imreadPlanes=cv2.split(img)Size_O=np.shape(img)Planes_C=np.zeros((size_O[2],size_O[0],size_O[1]))Planes_C_G=np.zeros((size_O[2],size_O[0],size_O[1]))clahe=cv2.createCLAHE(clipLimit=2,tileGridSize=(8,8))forjjinrange(3):Planes_C[jj]=clahe.apply(Planes[jj])

Planes_P_G[jj]=cv2.equalizeHist(Planes[jj])image_C=cv2.merge(Planes_C)image_C_G=cv2.merge(Planes_C_G)#image_C为经过自适应直方图均衡化后的RGB图像；image_C_G为经过全局直方图均衡化后的RGB图像。三、植物叶片气孔表型参数测量方法（2）气孔识别算法叶片气孔图像中，气孔与背景的颜色非常接近，用传统的方法很难识别。目前常用的方法是采用深度学习神经网络识别图像中气孔，包括识别气孔的关闭和打开。采用的深度学习神经网络主要有：FasterRCNN、FPN、YOLO等网络。19概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数Fetter等开发了基于显微图像的不同种类植物叶片气孔自动计数器，采用基于AlexNet的深度卷积神经网络（D-CNN）提取图像特征图，在不考虑图像边缘的气孔时，采用混合训练的模型对测试集气孔的识别率达到98.1%Li等采集黑杨、鸭跖草叶片气孔图像，采用基于VGG16网络的Faster-RCNN识别图像中的气孔及其位置，运用Chan-Vese模型分割出气孔孔隙，对孔隙边界进行椭圆拟合并计算孔隙的长度、宽度、面积、偏心率和开张度，但此方法不适合分割气孔图像比较模糊或气孔开度比较小的孔隙孙壮壮等采用YOLOv3算法对艾尼提便携式显微镜采集的小麦、大麦、水稻和玉米等单子叶作物叶片图像进行气孔识别与计数，该算法对气孔检测的精确率大于0.89，召回率大于0.42，F1值大于0.57，具有较好的模型泛化能力Liang等分别采用卷积神经网络FPN和FasterRCNN识别图像中的气孔个数，实验结果表明FPN比FasterRCNN适合检测TipScope采集的图像中的气孔，FasterRCNN比FPN适合检测ProScope采集的图像中的气孔，另外还采用FasterRCNN识别了ProScope采集的图像中打开气孔和关闭气孔的个数，自动测量值与人工测量值的决定系数(R2)高于0.98。三、植物叶片气孔表型参数测量方法（3）气孔孔隙分割算法目前气孔图像分割的方法主要分为四类：①利用图像处理软件，如借助ImageJ手动标记显微图像上的气孔特征点（如边界，长度，宽度），该方法需要人工干预，耗时耗力，主观性强。②利用经典的图像分割方法，如基于阈值、区域和能量泛函等的分割方法。③通过自制模板或借助椭圆拟合技术。④基于机器学习的方法。20概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数Omasa和Onoe于1984年提出采用阈值法分割气孔，提取孔隙区域，测量孔隙面积、孔隙长度和孔隙宽度，该方法适用于图像中仅有一个气孔的简单情况Toda等利用方向梯度直方图特征(HistogramofOrientedGradient,HOG)识别气孔并裁剪成单个气孔图像，使用卷积神经网络(ConvolutionalNeuralNetwork，CNN)将单个气孔图像分成气孔完全张开、气孔部分张开、气孔关闭等三类，再用阈值分割法对张开气孔图像进行分割并测量孔隙性状参数，该方法需要手动预定义面积、稳定度、长轴长度、质心坐标等参数Sanyal等采用分水岭的方法分割电子扫描图像中的气孔，用Sobel算子提取气孔边缘，此算法对气孔边缘不清晰或有噪声的情况下检测效果不好Liang等采用便携式显微镜采集了玉米叶片气孔图像，并基于改进的CV模型提取打开气孔孔隙的长度、宽度、面积、周长、偏心率、开度6个性状，与人工测量值相比较，6个性状的决定系数（R2）大于0.85三、植物叶片气孔表型参数测量方法在计算机视觉和模式识别等领域中，常用来评价目标识别算法的性能和效果的量化评价指标主要有以下6个。21概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

三、植物叶片气孔表型参数测量方法22概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

三、植物叶片气孔表型参数测量方法23概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

图10-9关闭气孔和孔隙表型参数测量流程图(a)关闭气孔；(b)打开气孔孔隙三、植物叶片气孔表型参数测量方法24概述气孔图像采集图像处理和分析方法量化评价指标气孔表型参数

四、叶片气孔表型在生物学中的应用25试验材料和仪器表型参数和试验结果试验材料：华中农业大学作物表型中心气孔研究团队以野生型‘B73’（敏感）和突变型‘Zmfab1a’（抗旱）为材料，研究了基于玉米叶片气孔表型的干旱响应。‘Zmfab1a’是基于‘B73’的甲基磺酸乙酯突变体，其野生型为‘ZmFAB1A’。试验处理：野生型‘B73’和突变体‘Zmfab1a’都分成两个组：对照组（WW）和干旱（DS）组。2021年5月26日，播种，从6叶期（播种后第27天）开始，干旱组停止浇水，对照组正常浇水，土壤水分含量（SM）采用DELTA-TsoilmoistureKit测定，干旱组从9叶期（播种后第36天）开始正常浇水。图像采集：利用ProScopeHR2和400镜头的显微镜分别在第32天、第35天、第36天和第37天采集玉米植株叶片气孔图像，每天采集6次图像，从上午8点到下午18点，间隔2h。其中干旱组第32天、第35天、第36天和第37天的平均土壤水分含量分别为15%、10%、25%和35%（图10-10a，图10-10b）。四、叶片气孔表型在生物学中的应用26图10-10野生型‘B73’和突变型‘Zmfab1a’在水分(WW)和干旱(DS)条件下的气孔动态响应(Liang等，2022)(a)野生型‘B73’在D32、D35、D36和D37土壤含水量分别为15%、10%、25%和35%时的气孔图像；(b)‘Zmfab1a’突变株在D32、D35、D36和D37土壤含水量分别为15%、10%、25%和35%时的气孔图像；(c)正常浇水和干旱胁迫下，‘B73’和‘Zmfab1a’4个气孔性状(打开气孔比率、孔隙总面积、气孔开度、单个气孔平均面积)4天平均值的t检验结果(**P<0.05;***P<0.01)；(d)‘B73’和‘Zmfab1a’4个性状4天的DS/WW变化曲线。试验材料和仪器表型参数和试验结果四、叶片气孔表型在生物学中的应用27提取表型：经过对气孔图像的处理和分析，提取了打开气孔比率、孔隙总面积、气孔开度、单个气孔平均面积等4个表型参数试验结果：结果表明打开气孔比率和孔隙总面积差异显著(**平均值P<0.05，***平均值P<0.01，图10-10c)，其余2个不显著。从图10-10c可以看出，在正常浇水条件下，‘B73’的打开气孔比率和孔隙总面积均高于‘Zmfab1a’，而在干旱条件下则相反。分别计算‘B73’和‘Zmfab1a’4个性状的干旱组与正常浇水组的比值（图10-10d），结果表明，干旱后再正常浇水，‘Zmfab1a’的打开气孔比率和孔隙总面积均高于‘B73’，这表明‘Zmfab1a’叶片气孔的恢复力高于‘B73’。试验材料和仪器表型参数和试验结果四、推荐阅读1.陈吉玉，冯铃洋，高静，等.光照强度对苗期大豆叶片气孔特性及光合特性的影响[J].中国农业科学，2019，52（21）：3773-3781.本文通过研究苗期大豆叶片在不同光照强度下气孔特征、光合作用以及糖类的变化，揭示大豆叶片在面对荫蔽时的光合作用和气孔特性的响应机制。2.王静涛，宋文龙，李克新，等.依据FasterR-CNN的活体植株叶片气孔检测方法[J].东北林业大学学报，2020，48（2）：4-39.

本文在详细研究叶片气孔显微图像特征的基础上，建立了一个基于FasterR-CNN目标检测框架的气孔识别网络模型，