CN119422203A 评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的方法和系统 （贝克顿·迪金森公司）

2025.01.08PCT/US2023/0234392023.05.24WO2023/235203EN2023.12.07评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料本发明提供了评估用于生成流式细胞仪数以及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪提供了用于实施本发明的系统和非暂态计算机21.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性的方法，所述方法包通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细315.一种评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性的方法，所述方法包通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细4[0002]本申请要求2022年6月1日提交的第63/347,848号美国临时专利申请的申请日优在确定患有各种疾病病症的患者的治疗方案中为前向散射光（FSC、粒子沿与激发激光器正交方向散射的激发光（称为侧向散射光各种细胞蛋白或其他成分进行标记后产生的光散射特性和荧光发射，可以标识不同的细胞[0006]在流式细胞术方案包括荧光检测的情况下，实验设计通常涉及标识荧光染料组以及由细胞仪激光器和流体力学随机波动产生的随信号强度呈二次曲线变化的乘性测量5噪声或扩散降低解混信噪比，且无法分辨多色流式细胞仪实验中生物标志物表达的差用的荧光基团数量设置了有效上限。实验操作人员在设计荧光染料组合时必须格外小心，预计会有较多的解混依赖性扩散或较少的解混依谱流式细胞仪使用的检测器数量多于荧光染料数量，市售全光谱流式细胞仪有180多个荧光通道可供使用。法定量预测解混扩散的严重程度。此外，条件数无法指示哪些荧光基团受解混扩散的影响两种荧光染料上的较高解混扩散度，而另一个条件数几乎完全相同的组合可具有更均匀分布在组合中更多荧光染料上的较低解混扩散度。不同尺寸组合上的条件数无法进行有意义的比较。可以从测量数据（如单染色粒子）中根据经验计算出替代指标，如溢出扩6[0012]本发明的各个方面包括评估用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合适用性的分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据及通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料，以评估荧光染料组合用于生成流式细胞仪数据的适用性。7[0036]图20展示了相似度分析在多大程度上无法预测荧光染料组合中将要出现扩散的[0037]图21展示了相似度分析在多大程度上无法预测荧光染料组合中将要出现扩散的8矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧[0050]本说明书中引用的所有出版物和专利通过本发明的引用开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。引用任何出版物的目的是在申请日之前出版日期可能与需要单独确认的实际出版日[0053]虽然为了语法上的流畅性和功能上的解释，已经或将要9细胞仪包括BDBiosciences生产的流式细胞仪。示例性流式细胞仪包括BDBiosciencesBiosciencesFACSLyricTM流式细胞仪、BDBiosciencesFACSVerseTM流式细胞仪、BDBiosciencesFACSymphonyTM流式细胞仪、BDBiosciBiosciencesLSRFortessaTMX_20流式细胞仪、BDBiosciencesFACSPrestoTM流式细胞BDBiosciencesFACSCountTM细胞分选仪、BDBiosciencesFACSLyricTM细胞分选仪、BDBiosciencesViaTM细胞分选仪、BDBiosciencesInfluxTM细胞分选仪、BDBiosciences胞分选仪、BDBiosciencesFACSAriaTMIII细胞分选仪、BDBiosciencesFACSAriaTMFusion细胞分选仪和BDBiosciencesFACSMelodyTM细胞分选仪、BDBiosciences[0058]另外，本发明的方法还包括获得与荧光染料组合和仪器标识符相关联的光谱矩[0061]在某些实施例中，本发明所述的光谱矩阵可包括一个或多个自发荧光光谱特自发荧光是在流式细胞仪中测量细胞等粒子时由粒子产生的内源荧光信号。自发荧淋巴细胞与单核细胞）不仅可具有不同的自发荧光水平，而且可具有不同的自发荧光[0064]At=(AA)-1A?[0067]y=Mff是荧光[0069]f=Mty[0077]从这一关系可以明显看出，所述光谱矩阵伪逆Mt决定了原始方差到解混方差V的映射。以下证明可以论证这一结论：令M表示[nxm]光谱矩阵和Mt表示[nxm]光谱,表示荧光基团j的解混方差，以及非对角元素fr，表示荧光基团j和k的解混协方差。[0090]如果还假设所有通道的检测器方差都相等，则与格拉姆逆矩阵(MTM)-1成正104包括基于步骤104中计算的定量指标，优化荧光染料组合。还可在步骤105中创建可视述，光谱和常规流式细胞术均可描述成线性混合模型f=Mty。如图3所示，方差也是从检阵伪逆Mt决定了原始方差vly]到解混方差vlfl的映射。如图2_3所示，所述光谱矩阵伪逆[0103]图5A_5D显示了根据本发明实施例所述的组合热点矩阵及其示例性计算过程。图的任何表示（例如图形表示用于评估和/或比较荧光基团中解混数据的标准偏差因特定图代表每个荧光基团中解混数据的标准偏差因组合中的解[0106]图6A_6B显示了基于组合热点矩阵创建的可视化。图6A显示了根据某些实施例所轴列出了不同的荧光基团，而y轴是标度，与荧光基团中解混数据的标准偏差因x轴上荧光基团构成的组合中解混而放大的系数相对应。在图6A的示例中，箭头所指的荧光基团联。这些荧光基团可标识为整个组合中受解混依赖性扩散影响最大的荧光基团。图6B显示了示例性流式细胞仪数据，表明了加入图6A中标识的荧光染料对数据质量的影响。所述数示。[0110]图7A_7E显示了根据本发明实施例所述的扩散相关矩阵及其示例性计算过程。图产生可理解的流式细胞仪数据，并且这些数据可靠提供了有关所研究样本的目标特点时，述经评估和/或标识荧光染料的其他荧光染料所能达到的生物分辨荧光染料组合进行优化，所述第18/083,808号美国专利申请的公开内容通过本发明的引[0114]目标方法进一步包括将第一荧光染料组合的评估与调整后荧光染料组合的评估进行比较。例如，方法可包括确定第一和调整后荧光染料组合中哪个荧光染料与流式细胞仪数据中的较小方差相关联。如果第一或调整后的荧光染料组合包括的与流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料少于另一个荧光染料组合，和/或具有与方差关联较小的荧光染料（例如由定量指标确定则可以认定此荧光染料组合更适用于生成流式细胞仪数据。在某[0116]图8显示了根据某些实施例所述的实施本发明方法的流程图。方法包括接收输入中改进或分析荧光染料组合。其中可包括在步骤803a中采用组合热点矩阵进行扩散可视发射波长为600nm_800nm的PhiYFP、PhiYFP_m、ZsYellow1、mBanana、KusabirTurboRFP、tdTomato、DsRed_Express2、TagRFP、DsRedmonomer、DsRed2（“RFP”）、获多色团系统中存在数量较多的单个发色团时，信号发色团的发射会放大；即，当入射光过泵浦光激发时更强烈。Brilliant™染料，例如BDH[0125]本主题荧光染料组合中的荧光染料和/或光谱矩阵中参照的荧光染料可能与生物抗体是一种具有70%或以上完整序列（例如在自然界中发现的完整序列例如75%或以上，对分子中一个成员的表面可具有与这对分子中另一个成员的表面区域或空腔特异性结合2片段器的类型和数量将根据样本以及所需的收集光而有所不同，可以是气体激光器，例如氦氖在其他实施例中，所述窄带光源包括一个或多个激光器（如激光阵列在范围为200nm_算出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相程序代码的计算机可读数据存储介质来实现荧光色素组合评估，所述程序代码包括指令，出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关估来优化荧光染料组合。如上所述，用于优化荧光染料组合的组合优化算法包括但不限于约束优化方法。在某些实施例中，所述处理器可产生用于生成流式细胞仪数据的荧组合的评估适用性的可视化。例如，可视化实施例突出显示了荧光色素组合中与使用此荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的荧光色素。在某些实施例中，所述可视化包括基于给定的荧光染料组合模拟的流式细胞仪数据图。换言之，所述可视化包括如果在配备有特定荧光染料组合的特定仪器上运行样本，则会产生示例性流式细胞仪数据。在其他版本中，所述可视化包括表格或矩阵，用于对荧光染料组合中荧光染料与方差的相关联[0160]本发明所述的前向散射光检测器可采用用于检测收集到的光的任何适宜检测1[0163]本发明所述的侧向散射光检测器可采用用于检测收集到的光的任何适宜检测1某些实施例中，所述检测器是光电倍增管，例如每个区域的有源检测表面积范围为0.01cm2析仪中的2个或多个检测器可测量收集到的光的相例中，目标流式细胞术系统包括BDBiosciencesFACSCanto™流式细胞仪、BDBiosciencesFACSCanto™II流式细胞仪、BDAccuri™流式细胞仪、BDAccuri™C6Plus流式细胞仪、BDBiosciencesFACSCelesta™流式细胞仪、BDBiosciencesFACSLyric™流式细胞仪、BDBiosciencesFACSVerse™流式细胞仪、BDBiosciencesLSRFortessa™X_20流式细胞仪、BDBiosciencesFACSPresto™流式细胞仪、BDBiosciencesFACSVia™流式细胞仪和BDBiosciencesFACSCalibur™细胞分选仪、BDBiosciencesFACSCount™细胞分选仪、BDBiosciencesFACSLyric™细胞分选仪、BDFusion细胞分选仪和BDBiosciencesFACSMelody™细胞分选仪、BDBiosciences和第2019/0376894号美国专利出版物；所述美国专利出版物的公开内容通过本发明的引[0173]图9显示了根据本发明说明性实施例所述的用于流式细胞术的系统900。系统900[0174]激发激光器915a_c发射激光束形式的光。在图9的示例系统中，从激发激光器[0177]荧光收集透镜940收集通过粒子与激光束的相互作用发射的光，并将其导向到一[0178]前向散射检测器930略微偏离通过流动室的直射光束的轴线，检测衍射光以及主增加而增加。可使用一个或多个荧光检测器960a_960f检测来自与粒子相关联的荧光分子[0179]本领域技术人员应认识到，根据本发明实施例所述的流式细胞仪不限于图9所示器990与检测器耦合以从其接收输出信号，还可与流式细胞仪910的电气和机电部件耦合，995、控制器/处理器990和I/O997可全部作为流式细胞仪910的组成部分。在此类实施例或全部可与细胞仪910进行无线或有线通信。控制器/处理器990与存储器995和I/O997一起执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各测器的光束路径中的滤波器和/或分束器的配置所定义的六个不同波段（在本发明中可称不同荧光分子将会以各自特有的波长带发光。为了与检测器的滤波器窗口大体上保持一体具有所述多个标记的子集。I/O997还可接收向一个或多个细胞群体分配一个或多个标选粒子，例如2017年3月28提交的第2017/0299493号美国专利出版物中描述的粒子分选模例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块分选样本的粒子（例如细胞例如于组分分选系统包括具有偏转板的粒子分选模块，如2017年3月28日提交的第2017/0299493些实施方式中，第一设备可实现为键盘1008或其他用于向处理器1000提供输入信号的装[0188]触发事件可使处理器1000改变数据显示方式以及显示设备1006上实际显示的数[0194]图11A是根据本发明一个实施例所述的粒子分选仪系统1100（例如流式细胞仪监测区1111的时间。检测站1114馈入定时电路1128，定时电路1128再馈入闪光充电电路定液滴驱动信号相位的作用。第7,679,039号美国专利对示例性液滴边界检测器进行了描确计算出每个检测粒子在液滴中的位置。检测系统1116可以馈入振幅信号1120和/或相位[0197]在某些实施方式中，分选电子设备（例如检测系统1116、检测站1114和处理器允许粒子继续沿流动路径1164流动。这种不带电的液滴可以经抽气机1170等进入废物容参与向计算机提供指令和数据以供执行和处理的过程的非暂态存储介质。在某些情况下，出的逆矩阵来标识荧光色素组合中与利用荧光色素组合生成的流式细胞仪数据方差相关现的方法时，可以以任意数量的计算机编程语言中的一种或多种语言进行编程。此类语言存储器和/或配合记忆存储设备使用的程序存储人数字助理等其他设备或任何其他可供用户结合使用的式计算机、家用电器等。在某些实施例中，所述服务器设备具有显示器（如液晶显示器[0216]在某些实施例中，所述通信接口通过采用上述一个或多个通信协议和/或机制的器可包括用于在系统与用户之间提供图形输入和输出接口以及处理用户输入信息的各种取决于所选择的计算机平台的类型和/或型号。合适的操作系统包括Windows®NT®、1210还可与存储器1270进行通信，并进一步通过输入/输出设备接口1240向可选显示器式细胞仪）的几组可使用荧光染料组合的场合。在某些情况下，本发明尤其适用于全介质有助于确定哪一组（哪几组）荧光染料有可能提供最优质的数据（例如最大生物分辨将光谱矩阵作为高计算效率的启发式优化来实现上述目的。位置打印的信息。这些指令的另一形式是包含信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘2相同的原始数据显示，在40C组合（图14B）和25C组合（图14A）中解混时，从R718到荧光染料的组合，绘制流式细胞仪数据图。关于热点1，获得了SparkNIR685/APC、BB700/PerCP_Cy5.5和PerCP/PerCP_Cy5.5的流式细胞仪数据。利用每个荧光染料对的效[0232]图16A_16D显示了关于热点1收集的流式细胞仪数据。图16A_16C分别显示了SparkNIR685/APC、SparkNIR685/VioR667和APC/VioR667荧光基团对结合自发荧光的流式[0233]图17A_17D显示了关于热点2收集的流式细胞仪数据。图17A_17C分别显示了来自PerCP/PerCP_Cy5.5荧光基团对的流式细料对中收集流式细胞仪数据。由此得到的流式细胞仪数据图如图18右侧所示。收集到的的每个组合制作了与组合热点矩阵所标识的受扩散影响的荧光染料相关流式细胞仪数据示的扩散相关矩阵。矩阵单元格以颜色编码，使单元格颜色与双阴性群体的倾斜程度相关联，即具有正相关或负相关。将此矩阵与上述图7A_7B所示所产生的扩散相关矩阵进行比标识了目标区域1_4。与目标区域1_4中标识的荧光染料对有关的流式细胞仪数据分别如图123456789PerCP_Cy5.5[0257]通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流[0272]11.根据前述条款中任一[0273]12.根据条款11所述的方法[0280]19.根据前述条款中任一项所述的荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的[0292]通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估[0308]35.根据条款34所述的系荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的[0327]通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流流式细胞仪数据方差相关联的荧光染料将产生流式细进一步包括基于对用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估来优化荧光染进一步包括产生用于生成流式细胞仪数据的荧光染料组合的评估适用荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的[0355]71.一种评估用于生成流式[0361]通过分析计算出的逆矩阵来标识荧光染料组合中与利用荧光染料组合生成的流式细胞仪数据的荧光染料组合的适用性评估[0378]82.根据条款81所述的方法荧光染料组合生成的流式细胞仪数据方差相关联的[0391]虽然为了理解清楚起见，已经通过说明和示例对上述发明进行了一些详细的描明的原理和诸位发明人为拓深领域而提供的概念,并且应解释为不限于这些具体列举的示