流式细胞术在白血病检测方面的研究进展

摘要 流式细胞术在白血病检测方面的研究进展摘要白血病是一种由造血组织病变所导致的恶性疾病，会使人体的许多重要功能器官和系统受到严重的损伤，进而严重影响到人们的日常生活，甚至最终可能会危及自身的生命。传统的白血病诊断治疗往往十分复杂，治疗所需时间较长且费用较高，而随着流式细胞术（flowcytometry,FCM)的快速发展，以其快速、精确等优势使得其在白血病的临床诊断中具有重要意义。本文主要就流式细胞术在白血病检测方面的应用，包括流式细胞术对白血病检测的原理，流式细胞术免疫分型对白血病外周血细胞以及脑脊液的检测，流式细胞术对白血病微小残留病变检测的优势和意义以及未来发展趋势等方面作一综述，以其为白血病的临床检测和治疗提供参考。关键词：流式细胞术，白血病，免疫分型，微小残留变1引言白血病是一种恶性的由前体或造血干细胞病变所引起的疾病。白血病是在人类疾病中较为多见的一种恶性疾病,且男性的发病率相比于女性而言要更高,在35岁以下的人群中，白血病的致病死亡率排名第一，这在女性的致病死亡率中排名第八位,而致病死亡率在男性中则位于第六位。白血病是由于发生病变的白细胞不断的进行分裂，进而使得细胞发生异常甚至不能够分化，进而抑制了细胞的正常凋亡,从而使得在各种组织系统中发生异常的病变，通过抑制这些组织,从而使得正常的造血功能紊乱并产生相应的临床症状。白血病大致包括急性白血病和慢性白血病,我国，诊断急性白血病的概率要更高，急性白血病又包括急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病等[1]。近年来临床上逐渐将流式细胞术应用于血液系统疾病的免疫分型以及对白血病微小残留病变进行有效的监测,这有利于对白血病进行诊断、治疗评估和可能的复发进行检测。流式细胞术对细胞或其他生物物质在分子水平上进行定性、定量分析和分选,其检测的速度较快、准确性好、精准度较高,现已成为了目前较为先进的细胞定量和分析技术。流式细胞术能够精确快速的测定细胞或者细胞器的生物学特性,并且可以分选和收集群体中特定的细胞以及细胞器，可对多个细胞进行快速分析和检测。目前流式细胞术免疫分型被认为是对白血病进行检测的重要指标,免疫分型是通过抗体对细胞所表达出的抗原进行特异性地检验，从而对多个细胞群的存在以及其所占的比例进行鉴定。在了解了相关的情况之后,可以更容易的体现出所测细胞的改变情况,是一种更为准确、快速的细胞系鉴定方法,对临床诊断及治疗具有积极意义。2流式细胞技术检测白血病的原理流式细胞技术可以从单个细胞中获得多种不同的参数，同时又能对多个细胞进行检测，是利用流式细胞仪对细胞进行测量,同时对单个细胞的多个参数进行定量分析的临床医学分析技术,并根据对物理、计算机技术、电子生物等技术学科的应用,对细胞进行精确的分析,包括细胞的生物学功能、电子算机技的特性等[2]。随着流式细胞技术不断被广泛应用,从单参数分析、双参数分析逐步发展成为多参数分析、定性检测逐步发展为定量检测，这使得流式细胞术被应用于多个临床检测领域,并且在未来的临床检测方面具有无可替代的重要作用[3]。2.1流式细胞仪的组成及工作原理流式细胞仪通过对细胞进行检查,从而可以对细胞进行精确的检测、储存、自动的分析和分选,体现细胞的许多重要的特征参数,而且可以按照这些预选的参数范围把特定的细胞筛选出来[4]。其结构组成及作用如下图所示：图1流式细胞仪的结构组成及作用2.2流式细胞仪对白血病进行检测的原理流式细胞仪能够对正常的血细胞采取细胞免疫分型检测,从某一阶段使得细胞分化受到阻遏，从而能够造成不同类别的白血病。常规的血细胞在细胞分裂、生长、细胞分化、并成为成熟的细胞的过程中,体现出了与细胞系列群体以及细胞的分化水平有关的特异性，并且抗原在细胞核、细胞膜或者细胞浆中出现、血细胞的所处的生长分化发育阶段均与其表达的增多或者减少甚至消失密切相关。因此，血细胞的鉴定与分类可以根据这些细胞表面抗原的表达与否来进行鉴别,所以在外形上尽管改变很大，然而仍可对白血病进行流式细胞免疫分型实现对白血病的检测。3式细胞术在白血病诊断中的应用3.1流式细胞术免疫分型的应用由于医疗诊断技术的不断创新和提高，采取先分型后治疗的方式能够显著的提高白血病治疗的准确性，流式细胞术是白血病免疫分型的一种重要手段，在单细胞形态之下辨别常规细胞和白血病细胞，用荧光单克隆抗体进行检测，从而可以获得多个参数，以此可以对细胞核、细胞质、细胞膜进行测验和分析，并进一步掌握该系列白血病细胞所属的种类以及其分化的水平，从而实现对白血病细胞的有效监测，用来进行检测的标本类型包括外周血、脑脊液等，从而能够避免临床形态学分型（FAB分型）方法的不足，可以反映出FAB分型未能检测出的生物学特性，从而更加深入了解白血病异质性状况，对预后指导具有积极的效果，白血病分型的准确性和诊断的灵敏度大大提升，这在下一步开展临床检测方面具有非常重大的应用意义[5]。3.1.1流式细胞术免疫分型检测白血病外周血细胞流式细胞术免疫分型可诊断形态学分型难以分类的白血病。也可诊断其他较为罕见的急性白血病，这对于确定白血病细胞是表现为淋巴细胞和髓细胞的特征，或者表达为一部分为淋巴细胞系，而另一部分则表达为髓细胞系特征，或者是由一系列向另一系列转换具有重要作用，细胞免疫分型是进行诊断的重要方式[6]，可通过对外周血细胞进行检测。葛丽卫等人[7]的研究报告显示，采用FCM检测142例急性白血病患者的外周血液样品，分析FCM检测的灵敏度及特异性在急性髓系白血病和急性淋巴性白血病检测中应用,其中共有急性髓系白血病患者88例，而急性淋巴白血病患者共有54例，FCM检测出的敏感性分别为96.6%和88.9%，其检测出的特异性分别为33.3%以及44.4%,由此可知FCM检测急性白血病患者外周血细胞具备较高的灵敏度。此外，在刘小双[8]的研究中，分别对急性髓系白血病患者和急性淋巴白血病患者采用相应的骨髓细胞形态学检测，并使用流式细胞术对外周血液样品进行检测，检查出在所有患者诊断结果中共包含有63例阳性和26例阴性患者，检测到复发率分别为阳性组的82.54%以及阴性的23.08%，由结果可得阳性患者的复发率较阴性患者要更加显著，差异也更加明显。同样，在丁娜娜[9]的研究报告中，将流式细胞术用于白血病外周血细胞，从而对急性白血病进行诊断，选取了142例急性白血病患者，做骨髓细胞形态学改变检测进行对比，同时应用流式细胞术对患者外周血标本进行检测，进而分析在在这两种类别的白血病中应用流式细胞术进行检测的灵敏性以及特异性，最终检测得到急性髓系白血病患者共有88例，急性淋巴白血病患者共有54例，其检验敏感性分别为96.6%以及88.9%，其检测的特异性分别为为33.3%以及44.4%，因此可以得出在急性白血病患者的临床检测时应用流式细胞技术具备较高的敏感度。综上所述，在对白血病患者进行外周血细胞检查时，应用流式细胞术免疫分型技术，这对急性白血病患者的检测具有较高的特异性以及敏感性，是一种较为有效的测定方案，将其应用于患者的复发率评估上也具有一定的积极作用，在医疗临床的推广使用上具有重要价值。3.1.2流式细胞术免疫分型对脑脊液进行检测对于减少中枢神经系统白血病的发生，提高急性淋巴细胞白血病患者的生存率，进行早期检测以及制定较好的治疗方案，这具有重要的临床应用价值，在脑脊液细胞涂片中是否存在白血病细胞，是目前对白血病的临床诊断的标准，但是这种方法所采取的细胞数量较少，而且会受到多种外界因素的干扰，对于早期的中枢神经系统白血病患者，漏诊率较高[10]。通过细胞表面的特异性抗原，应用FCM细胞免疫分型可以确定多个细胞群的特性，从而使其受自身细胞形态的影响较小，用这种方法来监测微量异常的细胞的十分敏感，流式细胞术方法在检测成人急性髓系白血病中枢神经系统白血病中具有重要的应用价值。脑脊液流式细胞术具有着较高的灵敏性，这对于中枢神经系统白血病的临床检测有着重要的意义。而且在发现早期、无症状的中枢神经系统侵染阶段中，流式细胞术具有着更大的临床优势。在刘占云等人[11]的研究中，采用流式细胞术方法进行检测，共有患者308例，其中共有221例患者进行了腰穿检查，有207例脑脊液样本同时进行了常规形态学及FCM检查，检测的样本中共发现有22例患者FCM呈阳性，阳性率为10.63％，仅有5例形态学检验发现异常细胞，对基线数据进行比较，结果发现脑脊液FCM呈阳性组初发时白细胞计数显著升高，FAB分型为M4及M5者占比较高，均与FCM阴性组差异有着重要的意义，伴有融合基因的患者在FCM呈阳性组中占31.8％，显著高于阴性组的8.6％，突变发生率在FCM呈阳性组中达22.7％，显著高于FCM阴性组的4.3％，并且FCM呈阳性组具有不良分子生物学、细胞遗传学预后的患者比例更高，2组危险分层差异具有非常重要的统计学意义。脑脊液流式细胞术检测呈阳性患者总生存率与阴性组相比差异无统计学意义。由此可得，流式细胞术检测能提高急性髓系白血病患者缓解后脑脊液异常细胞的检出率。在董德明等人[12]的研究报告中显示，用流式细胞术以及细胞形态学共同检测89例急性淋巴白血病患者，经脑脊液流式细胞术检测出23例异常表型的细胞，经脑脊液细胞形态学检测出10例异常细胞，其检出阳性率分别为25.84%以及11.24%，因此采用脑脊液细胞形态学检查的检出率要明显低于脑脊液FCM检查，由此可以得出综合运用流式细胞术检测可增加中枢神经系统白血病患者的诊断敏感性，此外，分析并对比流式细胞术检测结果、细胞形态学检测的结果以及脑脊液生化检测的结果，由此可以得到，中枢神经系统白血病的发病率在脑压正常的患者中较低，仅流式细胞术检测检出一例，而中枢神经系统白血病的发病率在脑压较高的患者中较高，这显示中枢神经系统侵染可引起患者脑压的变化，同时对于脑压异常的患者，需要加强对脑脊液的检测，发现早期中枢神经系统的侵染，因此，脑脊液FCM在急性淋巴白血病儿童中枢神经系统白血病诊断中拥有着重要的临床诊断意义，是脑脊液细胞形态学检测的一个重要方法。另外，在王永斌等人[13]的研究结果中，选择89例急性淋巴白血病患者脑脊液标本，采用脑脊液流式细胞检测技术、脑脊液细胞学法进行检测，对比分析两种检测方式对中枢神经系统白血病的检测情况，经脑脊液FCM共检测出23例异常表型的细胞，其检出阳性率为25.84％，而经脑脊液细胞学共检出10例异常细胞，其检出阳性率为11.24％，因此，脑脊液流式细胞术检出的阳性率要明显高于脑脊液细胞学检出的阳性率。综上所述，脑脊液流式细胞术检测填补了脑脊液细胞学检测的不足，在白血病并发中枢神经系统白血病的诊断中具有着重要的临床应用意义。流式细胞学检测方法应用于脑脊液检测能够提高成人急性髓系白血病患者脑脊液异常细胞的检出率，能够帮助早期发现以及干预中枢神经系统白血病，在临床检测中也具备重要的价值。3.2流式细胞术对白血病微小残留病变的动态监测微小残留病变是白血病患者在治疗结束后体内仍然存留的一定量的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞仍能够继续增殖从而引起白血病的复发，这是目前在临床上认为导致白血病复发的主要因素。近年来，微小残留病变被越来越多的应用于优化血液系统疾病的预后评定。监测微小残留病的一个重要原因就是监测白血病复发的可能性或者评估疾病复发的时间范围。一般而言白血病细胞属于表面抗原表型，具有异常光散射的特点，因此可以通过单克隆抗体、流式细胞术等来检验细胞表面不同抗原的荧光信号从而进行识别[14]。3.2.1流式细胞术检测微小残留病变的优势对微小残留病变进行监测准确度较高，检测更便捷，取材方便，敏感性较高，因此可以为后续的指导治疗和方案的调整提供更为准确的理论依据，并且可以监测白血病患者的预后巩固治疗的过程。在检验患者体内微小存留的白血病细胞时，需要找到该患者白血病细胞的遗传学、分子生物学以及免疫学的形态特征等重要的特异性标志。因而可以利用这些一般的普通血细胞所没有的特殊的标记从而区别于一般的细胞，进而能够对白血病细胞进行特异性地识别。微小残留病变的检测方式有很多，其中使用流式细胞术对白血病微小残留病变进行检验具备灵敏度高等多种优势，因此得以被广泛应用。（1）应用荧光原位杂交技术检测微小残留病变，根据检测时存在染色体异常，在白血病患者治疗后这些异常的染色体出现与否，以及这些异常的染色体出现的多少来鉴定微小残留病变是否发生。使用染色体或基因特异的核酸探针来检测染色体数目或结构的异常，分析特异的DNA序列。这种方法可以对多种染色体结构以及数量进行检测，能够了解初诊时白血病细胞染色体的数目或形态上的变化，然而这种方式仅仅适合于局部具备特殊遗传学特征的白血病细胞，检验的敏感性较低，而且操作技术方法较为复杂，所需的费用较高，从而不利于其在临床上的普遍使用。（2）聚合酶链式反应是检测微小残留病变灵敏度较高的措施，微小残留病变的检测基于特定的标记可以帮助我们预测白血病的复发以及决定最佳的诊断治疗方案，应用聚合酶链式反应检测急性淋巴细胞白血病患者微小残留病变时，常采用免疫球蛋白(Ig)或着是T细胞受体(TCR)的基因重排序列作为检测的标记，急性淋巴细胞白血病细胞大多数具有克隆性Ig基因或TCR基因重排，大部分的急性淋巴细胞白血病儿童患者的微小残留病变可通过重排基因进行检测，该方法敏感性高，主要的分子有T标记、融合基因、基因突变、免疫球蛋白的抗原受体重组等[15]。然而仅有少数的急性淋巴白血病和急性髓系白血病具备异常的分子生物学标志，对其余大部分的无分子生物学异常标记的患者来说并不适用。而对于具有异常分子标记的急性白血病中，由于聚合酶链式反应产物的数量与白血病细胞数量之间并没有明确的比例关系，因此只能对残存的白血病细胞进行定性监测，而无法做出精准的测定。另外，白血病细胞的分子标记的不确定性也为检测增加了难度。在白血病治疗或复发过程中，分子标记可能发生变化，使聚合酶链式反应技术出现漏检的现象，这不单增加了检验结果的假阴性率，同时也要求探索新的分子标记[16]。（3）白血病微小残留病变应用流式细胞术进行检测是利用了白血病细胞上白血病相关的免疫表型的表达与正常细胞的区别，白血病相关的免疫表型是指在正常骨髓没有或者很少见的一组抗原表达或流式细胞学参数，通过发现异常的骨髓细胞表面抗原表达细胞群而实现，从而成为鉴定白血病细胞和常规细胞的一种普遍检测手段，可以对需要检测的细胞进行快速的定性与定量检测，其检验的灵敏性可达10－4-10－5[17]。随着多色流式细胞仪的出现，其检验的灵敏性和特异性得到进一步提升，增加了FCM检测的灵敏度和适用范围。在阳文捷等人[18]的实验中，运用多参数流式细胞术来对白血病的微小残留病变进行检测，对白血病患者缓解后不同时期的体内所存微小残留病变进行检测，同时依据微小残留病变的多少分为高水平组，低水平组，阴性组，进而得出在诊断治疗期间，微小残留病变的存在水平会出现浮动，因此可及时调整治疗的方案，因此可以有效的降低微小残留病变的水平。所以应用流式细胞术的方法对微小残留病变进行检测更加简易方便，有助于对预后的判断，并及时对治疗方案进行调整。孙丽丽等[19]人同样应用多参数流式细胞术对白血病微小残留病变进行监测,实验选取了60例白血病患者，在治疗的过程中不断对骨髓形态学的变化进行检测，同时应用流式细胞术对患者的骨髓微小残留病变进行监测，将检测结果分为两组，阳性组为发现有异常表型的细胞，阴性组为未发现有异常表型的细胞，根据在第一次治疗结束后的检测结果可知，微小残留病变为阴性的患者其预后的效果比微小残留病变为阳性的患者要明显好，由此可知，应用流式细胞术动态监测微小残留病变的存在水平可以有效的判断白血病患者在治疗完成后的情况。FCM在细胞分子水平对细胞的荧光特性、颗粒、大小进行检测，从而定量检测白血病患者体内的微小残留病变的程度，不会受到分子生物学异常的影响，从而对微小残留白血病细胞进行更精确的检测，比聚合酶链式反应技术更加直观，应用更广泛，且适应性更强，特异性更高，敏感性更加准确，而且性价比较高，现在也已经成为检验微小残留病变的主要检测手段措施[20]。3.2.2流式细胞术对微小残留病变免疫学检测的意义微小残留病变被认为是在传统检测方法所能检测到的肿瘤细胞水平以下的长期存在的肿瘤细胞，这些微小残留病变如果积聚到相应的水平便能导致白血病的复发，这使得流式细胞仪能成为当今的研究微小残留病变的仪器,流式细胞术检测微小残留病变能对白血病的愈后进行有效的判断，流式细胞术对微小残留病变检测的敏感性取决于所要检验的细胞数目的多少以及所要鉴定的细胞与其他的细胞的不同,是在临床治疗方面的重要参考[21]，为临床检测提供了更为准确的参考依据。流式细胞术是目前检测微小残留病变较为成熟且应用最为普遍的技术。4展望综上所述，流式细胞术在对白血病免疫分型的分析，对白血病微小残留病变的检测等方面的应用使得其成为在白血病临床诊断辅助方面不可替代的技术，具有重要的临床应用价值，因其较高的精确性与速率使得逐渐成为了推动医学快速发展的新兴技术。未来流式细胞术的发展可能不仅仅是一个方法的改进，更有可能会推动检测技术的更新换代。但就目前而言流式细胞术需要具有较高的操作技术，需要使用特殊的仪器，数据分析较为繁琐，其操作流程也未能达到标准化，所需的费用较高，并且缺少重复性的检测结果，因此仍无法完全取代传统的诊断方法，要想流式细胞术在临床检测方面能获得长足的发展，就要追求更加经济、快捷、简便的方法，必须更加注重智能化的数据分析，检测结果要批量化，操作要更加规范化。相信随着电子计算机技术、生物技术、物理和光学技术的不断进步，流式细胞术在数据分析以及管理等方面也将会取得不断的发展，从而在白血病检测诊断领域获得更为广阔的应用前景。参考文献[1]王晓丽，陈治水，薛成军.急慢性白血病的血液生化学临床检验效果分析[J].包头医学，2019,43(2):44-46.[2]王建红.流式细胞技术在医学检验中的应用研究进展[J].临床检验杂志，2017,6(1):149-150.[3]程小艳，武会娟.流式细胞术最新进展及临床应用[J].中国免疫学杂志，2019(10):1270-1276.[4]金莹.流式细胞术对急性白血病免疫分型的临床意义[J].中国医药指南，2020,18(1):71.[5]孙丽丽，李慧波，孔德胜，等.流式细胞术动态监测微小残留病灶在急性髓系白血病中的意义[J].现代生物医学进展，2019,19(1):83-87.[6]周萍，唐吉斌.流式细胞免疫分型在临床的应用研究[J].国际检验医学杂志，2011，(16):74-76.[7]葛丽卫，王笑颜.流式细胞术用于白血病外周血细胞检测对急性白血病复发判断的意义[J].检验医学，2018,33(3):239-241.[8]刘小双.流式细胞术用于白血病外周血细胞检测对急性白血病复发判断的意义[J].临床检验杂志，2018，7(4):587-588.[9]丁娜娜.流式细胞术在急性白血病临床检验中的应用价值[J].临床研究，2018,26(8):141-142.[10]GongX，LinD，WangH，etal．Flowcytometricanalysisofcerebro-spinalfluidinadultpatientswithacutelymphoblasticleukemiaduringfollow－up［J］．EurJHaematol，2018，100(3):279－285．[11]刘占云，张赟翔，郝杰，等.流式细胞学在成人急性髓系白血病缓解后中枢神经系统白血病检测的临床应用及价值[J].临床血液学杂志，2020,3