CN119432994A 一种通过荧光成像检测单基因rna g4的试剂、方法及其应用 （广东工业大学）

一种通过荧光成像检测单基因RNAG4的试合到目标基因序列和rG4结构，触发空间临近触链，通过HCR反应，引发发卡H1和H2发生级联反21.一种通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂，其特征在于包含RNAG4结构靶向模所述的基因序列靶向模块的核酸序列至少包括分裂引发链2和目标基因RNAG4旁侧序所述的发卡H1的核酸序列，依次至少包括分裂引发链2的反向互补链所述的分裂引发链1和分裂引发链2的长度为10_20bp，分裂引发链2部分所述的目标基因RNAG4旁侧序列的互补序列的长度为12~30所述的点击基团包括但不局限于N3基团和DBC所述的识别或靶向G4结构的基团包括但不局限于G4结构靶向配体BYBX所述的BYBX衍生物为BYBX_5，该化合物与核酸的共价连接方式为：以BY所述的荧光基团_淬灭基团包括但不局限于ROX和B（1）将待测样本与权利要求1~7任一项所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂39.权利要求1~7任一项所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂或权利要求8所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的方法在检测RNAG4中的应10.权利要求1~7任一项所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂或权利要求8所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的方法在筛选调控RNAG4结构或功能的药物或筛选与RNAG4结合的蛋白中的应用。45该方法采用上述RNAG4结构靶向模块和基因序列靶向模块，同时结合到rG4结构和目标基[0009]本发明的再一目的在于提供上述通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂或通过荧光成像检测单基因RNAG4的方法的[0012]所述的基因序列靶向模块的核酸序列至少包括分裂引发链2和目标基因RNAG4旁发链2部分序列的反向互补链、分裂引发链1的反向互补链和上述若干碱基序列a的反向互[0016]所述的目标基因RNAG4旁侧序列的互补序列的长度可以为12~30bp，该序列优选[0017]所述的分裂引发链2和目标基因RNAG4旁侧序列的互补序列之间还可以包含由若6结构识别或靶向的策略均可以用于组装成本方案提出的基于点击化学和HCR的单基因rG4[0020]所述的识别或靶向G4结构的基团与分裂引发链1的连接方式包括但不局限于共价[0024]所述的荧光基团_淬灭基团包括但不局限于ROX和BHQ2等；所述的荧光基团_淬灭所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂还包括缓冲液和荧所述的缓冲液包括但不局限于SSC缓冲液，所述的荧光染色液包括但不局限于DAPI染色液；所述的缓冲液和荧光染色液还可以为本领域常见的其他缓冲液和荧光染色(DBCO)ACTGTGTGACTAGATATCAAAAAAAAAATAT+目标基因RNAG4旁侧序列的互补序7所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂或通过荧光成像检测单基因RNA所述的通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂或通过荧光成像检测单基因RNAG4的方法在筛选调控RNAG4结构或功能的药物或筛选与RNAG4结合的蛋白中的（2）在转染后的细胞中加入上述通过荧光成像检测单基因RNAG4的试剂中的RNA8有当基因序列靶向模块和RNAG4结构靶向模块同时结合目标G4时，点击化学反应才会发学反应复原的完整引发链可以正常触发HCR反应，没有复原的游离的模块没有引发HCR反引发链分别赋予序列靶向功能和结构靶向功能，即分裂引发链1共价连接上BYBX_5并在其3靶向模块和基因序列靶向模块，分别称之为RNAG4结构靶向模块和基因序列靶向成完整的成像方案。9及对应的发卡核酸可以实现在细胞中对单基因rG4的成像，操作简便性远远高于目前存在[0043]（3）本发明揭示了单基因rG4成像困难的根本原因是难以实现对G4序列特异性识予rG4成像方法以高序列特异性和高信噪比的科[0057]图12是基于点击化学和HCR的单基因rG4成像方法对293T细胞中BCL2基因mRNA5’[0060]1×PBS缓冲液：20×PBS缓冲液（上海生工B540627_0500）用DEPC处理水（雷根[0061]2×SSC缓冲液：20×SSC缓冲液（上海生工B548110_0200）用DEPC处理水（雷根序列名称完整引发链ICGGTGCCTCTGATTCCTGACTGTGTGACTAGATATC发卡H1GATATCTAGTCACACAGTCAGGAATCAGAGGCACCGCTGTATTATGACCGGTGCCTCTGATTCCTGACTGTG发卡H2CGGTGCCTCTGATTCCTGACTGTGTGACTAGATATCCACAGTCAGGAATCAGAGGCACCGGTCATAATACAGGATATCTAGTCACACAGTCAGGAAT(ROX)CAGAGGCACCGCTGTATTATGACCGGTGCCTCTGAT(BHQ2)TCCTGACTGTGCGGTGCCTCTGATTCCTGACTGTGTGACTAGATATCCGGTGCCTCTGATTCCTG(N3)(DBCO)ACTGTGTGACTAGATATCBCL2基因序列靶向模块(DBCO)ACTGTGTGACTAGATATCAAAAAAAAAATATCGGGGGCCAACGGCACCTCTCRANKL基因序列靶向模块(DBCO)ACTGTGTGACTAGATATCAAAAAAAAAATATCCCTCTCGCTTCGGAGCTCTCCRNAG4结构靶向模块(BYBX_5)TATCGGTGCCTCTGATTCCTG(N3)HelperRNAUAGUCACACAGUCAGGAAUCAGAG来。降温至30℃,降温完毕保存于4℃或_20℃。分别与I样暂存于4℃以备后续检测；[0089]HRMSm/z:cal价连接上BCL2基因rG4旁侧序列的互补链（CGGGGGC[0100]结果如图12所示。图12的A显示对照组因为没有加入基因序列靶向模块和RNAG4293T细胞细胞质中出现明显ROX荧光信号，说明基因序列靶向模块和RNAG4结构靶向模块共价连接上RANKL基因rG4旁侧序列的互补链（CCCTCTCGCTTCGGAGCTCTCC称之为RANKL基的2×SSC缓冲液和含RANKL基因序列靶向模块的2×SSC缓冲液各0.2ml，