T∕CNHAW 0024-2026 胎儿附属物组织采集与相关细胞制备储存技术要求

T∕CNHAW0024-2026胎儿附属物组织采集与相关细胞制备储存技术要求前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由中国民族卫生协会提出并归口。本文件起草单位：[填写起草单位全称，可多个，用顿号分隔]。本文件主要起草人：[填写主要起草人姓名，可多个，用顿号分隔]。本文件为首次发布。1范围本文件规定了胎儿附属物组织（包括胎盘、脐带、胎膜、绒毛膜等）的采集、运输、处理，相关细胞的分离、制备、检测，以及细胞冻存、储存、复苏、出库的技术要求、质量控制和安全管理。本文件适用于开展胎儿附属物组织采集与相关细胞制备、储存的医疗机构、生物样本库、细胞制备机构及相关科研单位，不适用于以临床治疗为目的的细胞制剂制备与储存。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T37864-2019生物样本库质量和能力通用要求GB/T39767-2021人类遗传资源样本采集、处理、储存和管理技术规范《药品生产质量管理规范》（国家药品监督管理局令第27号）《人类遗传资源管理条例》（国务院令第717号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胎儿附属物组织由胎儿衍生或与胎儿发育相关的附属组织，主要包括胎盘、脐带、胎膜、绒毛膜、蜕膜等，是连接母体与胎儿、为胎儿提供营养和氧气的重要组织，富含多种具有增殖分化潜能的细胞。3.2相关细胞从胎儿附属物组织中分离、培养获得的各类细胞，包括但不限于脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、绒毛膜细胞、羊膜上皮细胞等。3.3细胞制备从胎儿附属物组织中分离目标细胞，经培养、纯化、鉴定，获得符合质量标准的细胞群体的过程。3.4细胞冻存将制备合格的细胞在低温保护剂作用下，通过梯度降温，最终保存于超低温环境中，以维持细胞活性和功能的技术操作。3.5细胞复苏将超低温储存的细胞快速解冻，恢复细胞活性，用于后续培养或使用的技术操作。4组织采集技术要求4.1采集前准备4.1.1伦理与知情同意采集前需严格遵循伦理原则，按照《人类遗传资源管理条例》要求，向捐赠者（产妇）充分告知胎儿附属物组织采集的目的、过程、潜在风险及用途，签署书面知情同意书，明确捐赠意愿，严禁未经同意擅自采集。知情同意书需详细记录捐赠者基本信息、分娩信息、捐赠意愿及联系方式，归档留存，保存期限不少于30年。4.1.2人员要求采集人员需具备相应的医学或生物学专业资质，经过专业培训，熟练掌握采集操作流程、无菌技术及应急处理方法，定期进行健康检查，已知患有传染性疾病的人员不得参与采集操作。4.1.3器材与试剂准备采集所用器材（包括采集钳、剪刀、镊子、无菌容器、注射器、冰盒等）需经高压蒸汽灭菌或无菌处理，无破损、无污染；采集所用试剂（生理盐水、无菌缓冲液等）需符合医用标准，无细菌、真菌、支原体及病毒等外源因子污染，在有效期内使用。4.1.4环境要求采集操作需在符合无菌要求的环境中进行（如手术室、无菌采集室），环境温度控制在22℃~25℃，相对湿度40%~60%，操作前对环境进行消毒，确保无扬尘、无污染源。4.2采集操作规范4.2.1采集时机胎盘、脐带、胎膜采集应在胎儿娩出后、胎盘完全剥离娩出后30分钟内完成；绒毛膜组织采集宜在妊娠10周~12周之间（经活检采集）或早孕流产后立即完成，确保组织新鲜，减少细胞活性损失。4.2.2采集方法4.2.2.1脐带采集：胎儿娩出后，在距离胎盘端5cm和胎儿端5cm位置各留取约3cm长、外观正常的脐带组织，横断面切断，观察脐带血管（通常为1根静脉、2根动脉），去除表面血迹，放入预先装有预冷无菌生理盐水的无菌容器中，做好标记。如有明显异常（如血管畸形、破损），额外留取异常部位组织3cm。4.2.2.2胎盘采集：胎盘娩出后，立即观察并记录胎盘大小、形状、颜色，去除表面残留的胎膜、血块及异物，用无菌生理盐水冲洗干净，在胎盘中央区域取1块、旁中央区域取2块无明显病灶的组织，每块大小约2cm×2cm，自胎儿面向母体面贯穿取材；若胎盘切面有梗死、血肿等病灶，需在病灶处额外取1块组织，放入无菌容器中。4.2.2.3胎膜采集：顺产时，记录胎膜破口位置，自破口位置至胎盘边缘剪取部分胎膜组织；剖宫产时，自胎膜切口位置至胎盘边缘剪取部分胎膜组织，剪取时保留少量胎盘边缘用于位置区分，在破口处扎大头针防止羊膜、蜕膜移位，放入无菌容器。4.2.2.4绒毛膜采集：经腹部或经宫颈活检采集时，在超声引导下操作，避免穿刺针进入羊膜腔，用注射器以5~10mL负压吸取绒毛组织，立即放入预制的无菌培养基或生理盐水中，观察确认有绒毛组织；早孕流产后，用负压吸引器吸出绒毛组织，及时停止负压，将绒毛组织倒入无菌容器，用预冷生理缓冲液漂洗，去除血液。4.2.3采集后处理采集完成后，立即在无菌容器上标记捐赠者唯一标识、采集日期、采集时间、组织类型、采集部位等信息，避免混淆；将装有组织的无菌容器放入冰盒（4℃）中，做好密封，防止渗漏和污染。4.3采集质量控制4.3.1采集的组织需外观完整、无破损、无明显污染（如血迹残留过多、异物附着），绒毛组织需确认有典型绒毛结构，脐带组织无坏死、钙化。4.3.2采集过程需严格遵循无菌操作，避免组织被细菌、真菌等污染，操作过程做好详细记录，包括采集时间、部位、数量、操作人等信息，可追溯。4.3.3采集的组织需在规定时间内转运，不得延误，确保细胞活性。5组织运输要求5.1运输条件5.1.1运输温度：组织运输过程中需维持4℃±2℃低温环境，使用冰盒或专用低温运输箱，放入足量冰袋，确保温度稳定，严禁冷冻运输（特殊要求除外）。5.1.2运输时间：采集后的组织需在离体40分钟内启动转运，从采集地点到细胞制备实验室的运输时间不得超过2小时，如需进行细胞培养，需在取样后24小时内运至细胞培养室。5.1.3运输包装：将装有组织的无菌容器密封，放入密封袋中，做好防渗漏处理，再放入低温运输箱，箱外标记“易碎、低温、生物样本”标识，注明接收单位、接收人、联系方式及运输日期。5.2运输过程管理5.2.1运输过程中需避免剧烈震荡、挤压，防止无菌容器破损、组织受损。5.2.2安排专人负责运输，全程监控运输温度，做好运输记录，包括运输时间、温度变化、运输人、接收人等信息，确保可追溯。5.2.3运输至目的地后，接收人需立即核对组织信息、外观及温度，确认无误后签署接收记录，若发现组织污染、破损或温度异常，需及时上报并妥善处理，不得用于后续细胞制备。6细胞制备技术要求6.1制备前准备6.1.1环境要求细胞制备需在符合《药品生产质量管理规范》要求的洁净实验室中进行，洁净度不低于万级，局部操作区域（如生物安全柜）不低于百级，实验室温度控制在37℃±1℃，相对湿度50%±5%，定期进行环境微生物检测，确保无污染源。6.1.2人员与器材准备6.1.2.1制备人员需具备细胞生物学专业资质，经过专业培训，熟练掌握细胞分离、培养、纯化技术，严格遵守无菌操作规范，进入实验室需穿戴无菌衣、无菌手套、口罩、帽子，做好个人防护。6.1.2.2制备所用器材（培养皿、离心管、移液管、培养瓶等）需经无菌处理，无毒性、无残留；试剂（培养基、血清、胰蛋白酶、抗生素等）需符合细胞培养标准，无细菌、真菌、支原体、病毒等外源因子污染，人源或动物源性试剂需进行风险评估，细胞制备过程中不得使用青霉素或β-内酰胺类抗生素。6.1.3组织预处理接收组织后，立即在生物安全柜中进行预处理：用4℃预冷的无菌生理盐水或生理缓冲液反复漂洗，去除表面血迹、血块及异物，用无菌纱布吸干水分；将组织剪切成1mm~2mm的小块，放入无菌培养皿中，做好标记，备用。6.2细胞分离与培养6.2.1细胞分离根据不同组织类型和目标细胞，采用相应的分离方法：6.2.1.1酶解法：将剪碎的组织块放入无菌离心管中，加入适量的胰蛋白酶或胶原酶，37℃恒温孵育，期间轻轻震荡，直至组织块分散成单细胞悬液，加入含血清的培养基终止酶反应，离心（转速1000r/min~1500r/min，时间5min~10min），弃上清液，收集沉淀细胞。6.2.1.2机械分离法：对于质地较软的组织（如绒毛膜），可在无菌条件下用无菌镊子轻轻研磨，分散成单细胞悬液，经滤网过滤，去除组织碎片，离心收集细胞。6.2.2细胞培养6.2.2.1将收集的细胞重悬于适宜的培养基中，调整细胞浓度至1×10⁵个/mL~5×10⁵个/mL，接种于无菌培养瓶中，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。6.2.2.2培养过程中每天观察细胞形态、生长状态，及时更换培养基（通常每2天~3天更换一次），去除死细胞及代谢废物；若发现细胞污染（如出现浑浊、异味、异常沉淀），立即终止培养，妥善处理污染细胞及器材，防止污染扩散。6.2.2.3细胞传代：当细胞汇合率达到80%~90%时，进行传代培养，采用胰蛋白酶消化法，收集细胞，调整浓度后接种新的培养瓶，记录传代次数，二倍体细胞的细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内，连续传代细胞系可按固定传代比率传代，每传代一次视为一代。6.3细胞纯化与鉴定6.3.1细胞纯化采用密度梯度离心法、免疫磁珠分选法等，去除杂细胞，获得纯度不低于95%的目标细胞；纯化后的细胞需进行活力检测，细胞活力不低于90%。6.3.2细胞鉴定6.3.2.1形态学鉴定：在显微镜下观察细胞形态，确认目标细胞的典型形态特征（如间充质干细胞呈梭形、贴壁生长），记录细胞形态变化。6.3.2.2表面标志物鉴定：采用流式细胞术检测目标细胞的表面标志物，符合相应细胞的特征（如脐带间充质干细胞CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺，CD34⁻、CD45⁻），阳性表达率不低于95%，阴性标志物表达率不高于2%。6.3.2.3功能鉴定：根据细胞类型，进行相应的功能检测（如间充质干细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力检测），确保细胞具有正常的生物学功能。6.3.2.4微生物检测：对制备完成的细胞进行细菌、真菌、支原体、病毒检测，结果均为阴性；人源细胞需进行乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病病毒等病原体检测，确保无传染性病原体污染。6.4制备质量控制6.4.1制备过程需严格遵循无菌操作规范，做好每一步操作记录，包括试剂使用、细胞接种浓度、培养时间、传代次数、检测结果等，确保可追溯。6.4.2制备完成的细胞需符合以下标准：细胞活力≥90%，细胞纯度≥95%，微生物检测阴性，表面标志物及功能鉴定合格，无明显异常形态。6.4.3若细胞制备过程中出现异常（如污染、细胞活力过低、鉴定不合格），需及时终止制备，分析原因，妥善处理，不得将不合格细胞用于冻存或后续使用。7细胞冻存与储存技术要求7.1细胞冻存7.1.1冻存前准备7.1.1.1冻存试剂：配制冻存液，通常由培养基、血清、二甲基亚砜（DMSO）按一定比例组成（如培养基70%、血清20%、DMSO10%），冻存液需预冷至4℃，现配现用，DMSO需符合医用标准，无毒性。7.1.1.2细胞准备：选择处于对数生长期、活力≥90%的细胞，经消化、离心收集，用预冷的冻存液重悬，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL~5×10⁶个/mL，轻轻吹打均匀，避免产生气泡。7.1.2冻存操作7.1.2.1将重悬后的细胞悬液分装至无菌冻存管中，每管1mL~2mL，冻存管上标记捐赠者唯一标识、细胞类型、冻存日期、传代次数等信息，密封严密，防止漏液。7.1.2.2采用梯度降温法冻存：4℃放置30min，-20℃放置1h，-80℃放置过夜，次日转入液氮（-196℃）中储存；降温过程需缓慢、平稳，避免温度骤变损伤细胞，每一次冻存时均采用相同的降温过程，并记录冻存过程。7.1.2.3冻存过程中，冻存管需做好防护，避免碰撞、破损，放入液氮罐前需确认密封完好。7.2细胞储存7.2.1储存环境7.2.1.1细胞长期储存于液氮罐中，液氮液位需保持在冻存管以下，确保细胞完全浸没在液氮中，储存温度稳定在-196℃，定期检查液氮液位，及时补充液氮，防止液氮耗尽导致细胞受损。7.2.1.2液氮罐需放置在专用储存室，通风良好，远离火源、热源，做好安全防护措施，设置警示标识，防止液氮泄漏造成冻伤。7.2.2储存管理7.2.2.1建立细胞储存台账，详细记录捐赠者信息、细胞类型、冻存日期、传代次数、冻存管数量、储存位置等信息，实现一对一追溯，每一个细胞库冻存时，将同一次扩增的处于相同倍增水平的细胞培养物合并，混匀后分装，每支冻存管中的细胞数应足以保证细胞复苏后可获得有代表性的培养物。7.2.2.2液氮罐定期进行维护、清洁和消毒，每年进行一次密封性检测，防止泄漏；储存过程中，避免频繁开启液氮罐，减少温度波动，对于新的细胞库，除早代培养物在组织采集时或重组细胞筛选时可能需要使用抗生素外，细胞建库培养时不应使用抗生素。7.2.2.3不同捐赠者、不同类型的细胞需分区储存，做好明显标记，避免混淆；冻存管需按顺序摆放，便于查找和取用。8细胞复苏与出库技术要求8.1细胞复苏8.1.1复苏前准备7.1.1.1提前将培养基、血清等试剂预温至37℃，准备好无菌培养瓶、离心管、移液管等器材，确保无菌无污染。7.1.1.2从液氮罐中取出冻存管，快速核对标识，确认无误后，立即放入37℃水浴锅中快速解冻，不断轻轻摇晃冻存管，确保在1min~2min内完全解冻，避免细胞长时间处于低温或高温环境中受损。8.1.2复苏操作7.1.2.1解冻后的细胞悬液立即转入无菌离心管中，缓慢加入预温的培养基，轻轻吹打均匀，离心（转速1000r/min，时间5min），弃上清液，去除冻存液中的DMSO，避免损伤细胞。7.1.2.2用预温的培养基重悬细胞，调整细胞浓度，接种于无菌培养瓶中，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，24h后观察细胞贴壁情况，更换培养基，去除死细胞。7.1.2.3复苏后的细胞需进行活力检测，活力≥80%方可继续培养或使用；若细胞活力过低，需分析原因，必要时终止使用。8.2细胞出库8.2.1出库审核细胞出库前，需审核出库申请，确认出库用途、接收单位、接收人等信息，核对细胞标识、冻存日期、检测结果等，确保细胞符合出库要求，严禁不合格细胞出库。8.2.2出库操作8.2.2.1出库时，从液氮罐中取出冻存管，快速核对标识，放入低温运输箱（-196℃液氮或干冰）中，做好密封和防护，标记出库信息。8.2.2.2出库过程中，避免冻存管碰撞、破损，快速完成操作，减少细胞在常温下的暴露时间；做好出库记录，包括出库日期、细胞信息、接收单位、接收人、出库用途等，归档留存。8.2.3出库后跟踪细胞出库后，需跟踪接收单位的接收情况，确认细胞完好无损；若出现细胞破损、污染或活力异常，需及时沟通，分析原因，妥善处理。9安全管理与废弃物处理9.1安全