植物提取物中特征性多糖含量的测定高效液相色谱法

1植物提取物中特征性多糖含量的测定高效液相色谱法本标准规定了植物提取物中特征性多糖含量的测定方法。本标准适用于枸杞、黄芪、茯苓、灵芝等植物提取物中特征性多糖含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T66823术语和定义分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。3.1特征性多糖植物提取物中自身特有的、非淀粉质和非糊精类的水溶性多糖。4原理样品经淀粉酶水解，蛋白沉淀剂沉淀蛋白，无水乙醇沉淀多糖后，用三氟乙酸水解，在碱性条件下进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。5试剂和材料5.1试剂5.1.1水：GB/T6682，一级水。5.1.2淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。5.1.3三氟乙酸。5.1.4盐酸。5.1.5氢氧化钠。5.1.61-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，CAS号：89-25-8）。5.1.7甲醇。5.1.8乙腈。5.1.9三氯甲烷。5.1.10正丁醇。5.1.11无水乙醇。5.2溶剂配制5.2.1三氟乙酸溶液（4mol/L）：量取297mL三氟乙酸，用水稀释至1000mL，混匀。25.2.2氢氧化钠溶液（0.3mol/L)：称取1.2g氢氧化钠，加水溶解至100mL，混匀。5.2.350%氢氧化钠溶液：称取50g氢氧化钠，加入50mL水溶解，混匀。5.2.4盐酸溶液（0.3mol/L）：量取2.5mL盐酸，加水溶解至100mL，混匀。5.2.5PMP甲醇溶液（0.4355g/5mL）：称取0.4355g1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），加甲醇溶解至5mL，混匀。5.2.6Sevag试剂：将三氯甲烷和正丁醇按75：25的体积比混合均匀。5.2.76.8g/L磷酸二氢钾溶液：准确称取6.80g磷酸二氢钾，用900mL水溶解，用50%氢氧化钠溶液调节pH至6.70±0.2，并定容至1L。使用前用0.45μm微孔滤膜过滤。5.3标准品5.3.1D-(+)-葡萄糖标准品（C6H12O6，CAS号：50-99-7），纯度≥99%。5.3.2D-甘露糖标准品（C6H12O6，CAS号：3458-28-4），纯度≥99%。5.3.3D-半乳糖标准品（C6H12O6，CAS号：59-23-4），纯度≥99%。5.3.4L-鼠李糖标准品（C6H12O5，CAS号：3615-41-6），纯度≥90%。5.3.5L-(-)-岩藻糖标准品（C6H12O5，CAS号：2438-80-4），纯度≥99%。5.3.6D-葡萄糖醛酸标准品（C6H10O7，CAS号：6556-12-3），纯度≥99%。5.3.7D-半乳糖醛酸一水合物标准品（C6H10O7·H2O，CAS号：91510-62-2），纯度≥99%。5.3.8D-核糖标准品（C5H10O5，CAS号：50-69-1），纯度≥99%。5.3.9DL-阿拉伯糖标准品（C5H10O5，CAS号：147-81-9），纯度≥99%。5.4标准溶液配制5.4.1标准储备液A（10.0mg/mL）：准确称取按其纯度折算为100%质量的甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、核糖和阿拉伯糖标准品50mg（精确至0.1mg），加水溶解并分别置于5mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得到浓度为10.0mg/mL的标准储备液A。标准储备液可于4℃下保存3个月。5.4.2标准储备液B（100.0mg/mL准确称取按其纯度折算为100%质量的葡萄糖标准品1.000g（精确至0.1mg），加水溶解并置于10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得到浓度为100.0mg/mL的标准储备液B。标准储备液可于4℃下保存3个月。5.4.3标准系列工作液：分别吸取标准储备液A和B10μL、20μL、100μL、200μL、500μL和1.0mL于10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到标准系列工作液。甘露糖、半乳糖、鼠李糖、岩藻0.5mg/mL、1.0mg/mL；葡萄糖浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL。6仪器和设备6.1分析天平：感量为0.01g和0.0001g。6.2涡旋混合器。6.3恒温水浴装置。6.4电热恒温干燥箱。6.5氮气浓缩装置。6.6pH计。6.7离心管：15mL。36.8离心机：转速500r/min～5000r/min可调。6.9微孔滤膜：0.45μm，水相。6.10高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。7分析步骤7.1试样预处理称取试样0.1g（精确至0.001g）于15mL离心管中，加入0.01g淀粉酶，加10mL水溶解，涡旋混合器上振荡3min，37℃恒温水浴酶解30min。取出冷却至室温，加入Sevag试剂2.5mL，涡旋混合器上振荡3min，5000r/min离心5min，取上层水相转移至另一15mL离心管中，再加入Sevag试剂2.5mL重复除蛋白1次，取上层水相至50mL离心管中，加入40mL无水乙醇过夜。以5000r/min离心5min，弃去上清液，加水复溶沉淀，并定容至10mL。7.2试样水解准确移取1mL上述样品于15mL离心管中，加入1mL4mol/L三氟乙酸溶液，充氮气封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后开盖，加入2mL甲醇，氮气吹干，重复加入甲醇并氮气吹干3次以去除三氟乙酸，加入1mL水复溶残渣。7.3衍生反应准确移取待衍生试样溶液100μL至15mL离心管中，加入100μL0.3mol/L氢氧化钠溶液，涡旋混合器上振荡1min，再加入100μL0.5mol/LPMP甲醇溶液，涡旋混合器上振荡1min；在70℃水浴中反应30min，取出放置10min冷却至室温，加入100μL0.3mol/L盐酸溶液中和，加水定容至1mL。加入2mL三氯甲烷，振摇，4500r/min离心3min，弃去三氯甲烷层，如此萃取2次。将水相用0.45μm微孔滤膜过滤后供HPLC进样分析。另准确移取100μL标准系列工作液，与待衍生试样溶液同步进行衍生。7.4液相色谱参考条件7.4.1色谱柱：C18色谱柱，250mm×4.6mm×5μm，或性能相当者。7.4.2柱温：30℃。7.4.3检测波长：250nm。7.4.4流动相：6.8g/L磷酸二氢钾溶液：乙腈=83：17。7.4.5流速：1.0mL/min。7.4.6进样量：10μL。7.5标准曲线的制作将衍生后的混合标准工作液分别注入高效液相色谱仪中，以混合标准系列工作液中各单糖的质量浓度为横坐标，以各单糖的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。标准溶液衍生后的色谱图见附录A中图7.6试样溶液的测定将衍生后的待测液注入高效液相色谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测溶液中各单糖的质量浓度。待测液中目标化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应对待衍生试样溶液进行稀释，重新按样品衍生分析步骤处理后再进行分析。7.7分析结果的表述试样中各单糖的含量按公式（1）进行计算：Xif..............................................................（1）式中：Xi——试样中各单糖的含量，单位为毫克每克（mg/g）；4——标准曲线得c到的试样溶液中各单糖的质量浓度，单位为微克每毫升（mg/mL）；V——试样定容的体积，单位为毫升（mL）；f——稀释倍数；m——试样的取样量，单位为克（g）。试样中多糖的含量公式（2）进行计算X=ΣXi..............................................................（2）式中：Xi——试样中各单糖的含量，单位为毫克每克（mg/g）；X——试样中多糖的含量，单位为毫克每克（mg/g）。试验结果以平行测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应