miR-1254表达缺失：解锁乳腺癌关键奥秘与潜在治疗靶点

miR-1254表达缺失：解锁乳腺癌关键

奥秘与潜在治疗靶点

一、引言

1.1研究背景与意义

乳腺癌作为全球女性健康的重大威胁，在癌症相关死亡原因中占据重要地位。根据世界卫生组

织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据，乳腺癌新发病列高达

226万例，超越肺癌成为全球第一大癌症，死亡人数达68万例。在我国，乳腺癌同样呈现出

高发病率的态势，且发病年龄有年轻化趋势。其不仅严重影响患者的生理健康，还对患者的心

理健康和生活质量造成极大的负面影响，给家庭和社会带来沉重的经济负担。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22nt的内源性非编码单链RNA分子，通

过与靶mRNA的3'-UTR区域互补配对，抑制mRNA的翻译过程或促使其降解，从而实现对

基因表达的精细调控。大量研究表明，miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥

关键作用，其表达异常与多种人类疾病，特别是癌症的发生发展密切相关。在乳腺癌中，

miRNA参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及对化疗药物的耐药等多个关键环节，因此，

深入研究miRNA在乳腺癌中的作用机制，对于揭示乳腺癌的发病机制、寻找新的诊断标志物

和治疗靶点具有重要怠义。

miR-1254作为miRNA家族的重要成员，近年来逐渐成为肿瘤研究领域的热点。已有研究报

道，miR-1254在多种肿瘤组织中呈现出异常表达，并且在肿瘤细胞的生物学行为调控中发挥

重要作用。在乳腺癌的研究中，miR-1254表达缺失与乳腺癌的发生发展存在紧密联系，但其

具体作用机制尚未完全明确。进一步探究miR-1254表达缺失在乳腺癌中的关键作用，有望为

乳腺癌的早期诊断、预后评怙和靶向治疗提供新的理论依据和治疗策略，具有重要的科学研究

价值和临床应用前景。

1.2研究目的与问题提出

本研究旨在深入揭示miR-1254表达缺失在乳腺癌发生、发展及转移过程中的关键作用及其潜

在分子机制。具体而言，通过一系列体内外实验，全面探究miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞

生物学行为，如增殖、凋亡、侵袭和转移等的影响；明确miR-1254调控乳腺癌的相关信号通

路和潜在靶基因；评估miR-1254作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的可行性和临床应用价

值。

基于上述研究目的，本研究拟解决以下关键问题：一是miR-1254在乳腺癌组织和细胞中的表

达水平与乳腺癌临床病理特征及预后之间的关联如何；二是miR-1254表达缺失如何影响乳腺

癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程；三是miR-1254调控乳腺癌细胞生物学行为

的具体分子机制是什么，涉及哪些信号通路和靶基因；匹是能否将miR-1254作为乳腺癌早期

诊断的新型分子标志物以及开发基于miR-1254的乳腺癌靶向治疗策略。对这些问题的解答，

将为深入理解乳腺癌的发病机制提供新的视角，为乳腺癌的精准诊断和治疗提供重要的理论依

据和实验基础。

1.3研究方法与技术路线

1.3.1研究方法

细胞实验：选用多种乳腺癌细胞系，如MDA-MB-231、MCF-7等，以及正常乳腺上皮细胞系

作为对照。利用慢病毒转染技术构建miR-1254稳定过表达和敲低的乳腺癌细胞模型通过

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot技术检测转染效率。运用CCK-8、EdU等

实验检测细胞增殖能力；采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术分析细胞凋亡情况；

借助Transwell小室实验和划痕愈合实验评估细胞的侵袭和迁移能力。

动物实验：选取无胸腺裸鼠，将构建好的稳定转染的乳腺癌细胞系接种到裸鼠乳腺脂肪垫或尾

静脉，建立乳腺癌原位移植瘤模型和肺转移模型。定期观察裸鼠的生长状态、肿瘤体积变化

等，实验结束后处死裸鼠，获取肿瘤组织和转移灶，进行病理分析、免疫组化、qRT-PCR和

Westernblot等检测，以研究miR-1254表达缺失对肿瘤生长和转移的影响。

生物信息学分析：利用生物信息学数据库和工具，如TargetScan、miRDB、StarBase等，预

测miR・1254的潜在靶基因。对预测结果进行功能富集分析，包括GO(GeneOntology)功

能注释和KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)信号通路富集分析，筛选出

与乳腺癌发生发展密切相关的靶基因和信号通路°结合乳腺癌患者的临床数据，分析miR-

1254表达水平与靶基因表达及患者预后的相关性。

临床样本检测：收集乳腺癌患者的肿瘤组织和癌旁正常叁织样本，以及患者的血清样本，同时

收集患者的临床病理资料，包括年龄、肿瘤大小、TNM分期、组织学分级、淋巴结转移情况

等。运用qRT-PCR技术检测组织和血清中miR-1254的表达水平，通过免疫组化或ELISA

等方法检测相关蛋白的表达，分析miR-1254表达与临床病理特征及预后的关系。

分子生物学实验：采用荧光素酶报告基因实验验证miR-1254与靶基因3-UTR的直接相互作

用。构建包含靶基因3-UTR野生型和突变型的荧光素酶报告载体，分别与miR-1254mimic

或inhibitor共转染至乳腺癌细胞中，检测荧光素酶活性。运用RNA免疫沉淀(RIP)实验进

一步验证miR-1254与靶基因在细胞内的结合情况。通过Westernblot和qRT-PCR检测

miR-1254对靶基因蛋白和mRNA水平的影响，以及对相关信号通路关键蛋白的调控作用。

1.3.2技术路线

首先，收集乳腺癌患者的临床样本，包括肿瘤组织、癌旁组织和血清，同时收集患者的临床病

理信息。利用qRT-PCR检测miR-1254在临床样本中的表达水平，并分析其与临床病理特征

及预后的相关性。然后，在体外细胞实验中，构建miR-1254过表达和敲低的乳腺癌纽胞模

型，通过一系列细胞功能实验，如增殖、凋亡、侵袭和迁移实验，研究miR-1254表达缺失对

乳腺癌细胞生物学行为的影响。接着，运用生物信息学方法预测miR-1254的潜在靶基因，通

过荧光素酶报告基因实验、RIP实验等进行验证，并检测miR-1254对靶基因及相关信号通路

的调控作用。在体内动物实验方面，建立乳腺癌原位移植瘤模型和肺转移模型，观察miR-

1254表达缺失对肿瘤生长和转移的影响，通过对肿瘤组织的病理分析和分子生物学检测，进

一步验证体外实验结果。最后，综合临床样本检测、体外细胞实验、体内动物实验和生物信息

学分析的结果，深入探讨miR-1254表达缺失在乳腺癌中的关键作用及其分子机制，为乳腺癌

的诊断和治疗提供新的靶点和策略。

二、乳腺癌与miR-1254的研究现状

2.1乳腺癌概述

2.1.1乳腺癌的发病机制

乳腺癌的发生是一个多阶段、多因素共同作用的复杂过程，涉及遗传、激素、环境等多种因素

的相互影响。在遗传因素方面，BRCA1、BRCA2等基因突变显著增加了乳腺癌的发病风险。

携带BRCA1基因突变的女性，其一生患乳腺癌的风险可高达40%-80%。这些基因突变会导

致DNA损伤修复机制异常，使得细胞基因组不稳定，容易引发肿瘤的发生。除了遗传因素

外，激素水平的失衡也在乳腺癌的发病中起着关键作用。雌激素、孕激素等性激素通过与乳腺

细胞表面的受体结合，激活一系列信号通路，调控细胞的增殖、分化和凋亡。当体内激素水平

长期处于异常状态时，如雌激素水平过高或孕激素水平相对不足，会持续刺激乳腺细胞增殖，

增加基因突变的概率，进而促使乳腺癌的发生。

乳腺癌的发生发展过程伴随着一系列基因和信号通路的异常改变。癌基因的激活和抑癌基因的

失活是乳腺癌发生的重要分子基础。例如，HER2基因的扩增和过表达在约20%-30%的乳腺

癌患者中出现，HER2蛋白过度表达会激活下游的PI3K/AKT、RAS/MAPK等信号通路，促

进细胞的增殖、存活和迁移，使肿瘤细胞具有更强的侵袭性和恶性程度。而p53、PTEN等抑

癌基因的突变或缺失，则会导致细胞失去正常的生长调控和凋亡机制，使得肿瘤细胞得以逃避

机体的免疫监视，不断增殖和扩散。PI3K/AKT/mT0R信号通路在乳腺癌中常常处于异常激活

状态，该通路通过调节细胞的代谢、蛋白质合成和细胞周期进程，促进肿瘤细胞的生长和存

活。抑制该信号通路的活性，能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。

乳腺癌的形成可大致分为四个阶段。第一阶段为基因突变，致癌因素导致乳腺细胞的DNA发

生突变，使细胞生长和分裂的调控机制出现异常。第二阶段是细胞增生，突变的细胞开始不受

控制地增殖，形成微小的肿瘤。第三阶段为肿瘤生长，肿瘤细胞不断分裂和增殖，肿瘤体积逐

渐增大，并开始侵犯周围的组织和器官。第四阶段是乳腺癌转移，肿瘤细胞通过血液循环或淋

巴系统扩散到身体的其他部位，形成远处转移灶，此时乳腺癌的治疗难度大大增加，预后也相

对较差。

2.1.2乳腺癌的临床特征与治疗手段

乳腺癌的临床症状表现多样，乳房肿块是最为常见的症状，多为无痛性、质地较硬、边界不清

的肿块，部分患者可能伴有乳房疼痛、乳头溢液、乳头凹陷、乳房皮肤橘皮样改变或酒窝征等

症状。乳头溢液可能表现为血性、浆液性或脓性液体，乳头凹陷则是由于肿瘤侵犯乳腺导管，

导致导管缩短牵拉乳头所致。乳房皮肤的橘皮样改变是因为癌细胞阻塞淋巴管，引起局部淋巴

水肿，而酒窝征是由于肿瘤侵犯Cooper韧带，使其缩短并牵拉皮肤造成的。腋窝淋巴结肿大

也是乳腺癌常见的体征之一，提示可能存在癌细胞的淋巴转移。

在乳腺癌的诊断方面，目前主要依靠多种检查方法的综合应用。乳腺X线铝靶摄影是乳腺癌

筛查的重要手段之一，能够发现乳腺内的微小钙化灶和肿块，对于早期乳腺癌的诊断具有重要

价值。乳腺超声检查则适用于各个年龄段的女性，尤其是对致密型乳腺的检查效果更佳，可清

晰显示乳腺肿块的大小、形态、边界和血流情况，有助于判断肿块的良恶性。磁共振成像

（MRI）具有高分辨率和多方位成像的特点，对于检测乳腺癌的多中心病灶、评估肿瘤的范围

和侵犯程度以及鉴别乳腺良恶性病变具有独特优势，常用于乳腺癌的术前评估和高危人群的筛

查。除了影像学检查外，组织病理学检查是确诊乳腺癌的金标准，通过穿刺活检或手术切除

获取病变组织，进行病理切片和免疫组化分析，可明确肿瘤的组织学类型、分级和分子分型，

为后续的治疗方案制定提供重要依据。

乳腺癌的治疗方法主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等，具体治疗方案

需根据患者的肿瘤分期、病理类型、分子分型、年龄以及身体状况等因素综合考虑，制定个体

化的综合治疗方案。手术治疗是乳腺癌的主要治疗手段之一，包括乳腺切除术和保乳手术。乳

腺切除术适用于肿瘤较大、多中心病灶或不适合保乳的患者；保乳手术则在切除肿瘤的同时保

留乳房的外形，适用于肿瘤较小、位置合适且患者有保乳意愿的情况，术后通常需要配合放疗

以降低局部复发风险。化疗是使用化学药物杀死癌细胞的全身性治疗方法，可在手术前（新

辅助化疗）、手术后（辅助化疗）或晚期乳腺癌患者中应用。新辅助化疗能够缩小肿瘤体积，

提高手术切除率，同时还可以评估肿瘤对化疗药物的敏感性；辅助化疗则可以杀灭可能残留的

癌细胞，降低复发和转移的风险。放疗是利用高能射线对肿瘤部位进行照射，杀死癌细胞或

抑制其生长，主要用于术后埔助治疗，以降低局部复发的风险，对于局部晚期乳腺癌或出现远

处转移的患者，放疗也可用于缓解症状和控制肿瘤进展。

内分泌治疗主要针对激素受体阳性（雌激素受体ER和/或孕激素受体PR阳性）的乳腺癌患

者，通过药物或手术的方式降低体内雌激素水平或阻断雌激素的作用，从而抑制肿瘤细胞的生

长。常用的内分泌治疗药物包括他莫昔芬、芳香化酶抑制剂等，他莫昔芬适用于绝经前和绝经

后的患者，通过与雌激素受体结合，阻断雌激素的作用；芳香化酶抑制剂则主要用于绝经后的

患者，通过抑制芳香化酶的活性，减少雌激素的合成。靶向治疗是近年来乳腺癌治疗领域的

重要进展，针对乳腺癌细胞表面的特定分子靶点，如HER2、PI3K等，使用特异性的靶向药

物进行精准治疗。对于HER2阳性的乳腺癌患者，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等HER2靶向药

物能够显著提高治疗效果，延长患者的生存期；针对PI3K/AKT/mT0R信号通路的抑制剂也

在临床研究中显示出良好的应用前景。

2.2miR-1254相关基础

2.2.1miR-1254的结构与功能特性

miR-1254基因位于人类染色体的特定区域，其前体miRNA(pre-miR-1254)具有典型的

茎环结构，长度约为70-1C0nto这种茎环结构是miRNA在细胞核内由RNA聚合酶E转录

生成初级miRNA(pri-miRNA)后，经过核酸酶Drosha及其辅助因子DGCR8的加工，切

割掉pri-miRNA的侧翼序列而形成的。pre-miR-1254随后被转运蛋白Exportin-5转运至

细胞质中，在核酸酶Dicer的作用下，进一步切割成为成熟的miR-1254,其长度约为

22nto

成熟的miR-1254通过与AGO蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC),发挥其对靶

基因的调控作用。miR-1254主要通过与靶mRNA的3'•UTR区域互补配对，抑制rTRNA的

翻译过程，从而减少靶蛋白的合成；在某些情况下，当miR-1254与靶mRNA的互补配对程

度较高时，也可以促使靶mRNA降解，从转录后水平调控基因表达。研究表明，miR-1254

可以调控多个与细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学过程密切相关的基因，如通过靶向调控

某些癌基因或抑癌基因，参与肿瘤细胞的生物学行为调控。

2.2.2miR-1254在正常生理状态下的表达与功能

在正常乳腺组织中，miR-1254呈现出相对稳定的表达水平，对维持乳腺细胞的正常生理功

能起着重要作用。它参与调控乳腺细胞的增殖、分化和凋亡过程，确保乳腺组织的正常发育和

稳态平衡。在乳腺发育的不同阶段，miR7254的表达水平会发生动态变化，如在青春期乳

腺组织快速增生阶段，miR-1254的表达可能会有所上调，以促进细胞的适度增殖和分化；

而在哺乳期结束后乳腺组织的退化阶段，miR-1254可能参与调控细胞的凋亡过程，使乳腺

组织恢复到正常状态。

除了在乳腺组织中发挥作用外，miR-1254在其他多种正常组织中也有表达，如心脏、肝

脏、肺、肾脏等，且在不同组织中的表达水平存在差异。在心脏组织中，miR-1254参与心

肌细胞的生长、分化和心脏功能的调节，对维持心脏的正常结构和功能具有重要意义,在肝脏

中，miR・1254可能参与肝细胞的代谢调节和肝脏的解毒功能，对维持肝脏的止常生理功能

起着不可或缺的作用。这些研究表明，miR7254在正常生理状态下广泛参与多种组织和细

胞的生理过程，是维持机体正常生理功能的重要调控分子。

2.3miR-1254与乳腺癌关系的前期研究

早期关于miR-1254与乳腺疡关系的研究主要聚焦于其在乳腺癌组织和细胞中的表达差异。通

过对大量乳腺癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常组织进行检测分析，发现miR-1254在乳腺癌

组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织，且这种表达缺失与乳腺癌的某些临床病理特征密切

相关。研究表明，miR-1254表达缺失与乳腺癌的肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移等因素

存在显著关联。在肿瘤较大、TNM分期较晚以及伴有淋巴结转移的乳腺癌患者中，miR-

1254的表达水平更低，提示miR-1254表达缺失可能在乳腺癌的进展和转移过程中发挥重要

作用。

在乳腺癌细胞系的研究中，同样发现miR-1254在多种乳腺癌细胞系中的表达低于正常乳腺上

皮细胞系。通过在乳腺癌细胞中人为改变miR-1254的表达水平，初步探讨其对乳腺癌细胞生

物学行为的影响。当在乳腺癌细胞中过表达miR-1254时，细胞的增殖能力受到抑制，凋亡率

增加；而抑制miR-1254的表达后，乳腺癌细胞的增殖能力增强，凋亡受到抑制。这些早期

研究结果初步表明，miR-1254在乳腺癌中可能作为一种抑癌基因发挥作用，其表达缺失与乳

腺癌的发生发展密切相关，但具体的作用机制尚未完全明确，仍需进一步深入研究。

三、miR-1254表达缺失与乳腺癌细胞特性改变

3.1细胞实验设计与实施

3.1.1细胞系选择与培养

本研究选用了多种具有代表性的乳腺癌细胞系，包括MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-

3等。MDA-MB-231细胞系是一种高度侵袭性的三阴性乳腺癌细胞系，缺乏雌激素受体

(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达，具有较强的迁移和

侵袭能力，常被用于研究乳腺癌的转移机制。MCF-7细胞系是雌激素受体阳性的乳腺癌细胞

系，对雌激素具有依赖性，其生长和增殖受到雌激素的调控，常用于研究乳腺癌的内分泌治疗

和细胞增殖相关机制。$长-8口-3细胞系则是^^口2过表达的乳腺癌细胞系，HER2基因的

扩增和过表达使其具有较强的增殖活性和恶性程度，是研究HER2靶向治疗和相关信号通路

的常用细胞系。同时，选取正常乳腺上皮细胞系MCF10A作为对照，MCF10A细胞系具有正

常乳腺上皮细胞的生物学特性，能够维持正常的细胞形态和功能，用于对比乳腺癌细胞在

miR-1254表达缺失情况下的异常生物学行为。

所有细胞均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),在含有10%胎牛血清(FBS)、100

U/mL青霉素和100pg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中培养，置于37。5%CO2的恒温

培养箱中，定期更换培养基，当细胞密度达到80%-90%时进行传代。传代时，先用胰蛋白

酶-EDTA消化液消化细胞，然后加入适量的培养基终止消化，吹打均匀后将细胞悬液按1：3

-1:4的比例接种到新的培养瓶中继续培养。在细胞培养过程中，密切观察细胞的生长状态，

包括细胞形态、密度、贴壁情况等，确保细胞处于良好的生长状态，以保证后续实验结果的准

确性和可靠性。

3.1.2miR-1254表达缺失模型构建

采用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术构建miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞模型。首

先，设计并合成针对miR-1254的短发夹RNA(shRNA)序列，同时设计阴性对照shRNA

序列。将shRNA序列克隆到慢病毒载体中，与包装质粒共转染293T细胞，进行慢病毒的包

装和生产。收集含有慢病毒的上清液，通过超速离心法浓缩病毒液，测定病毒滴度。

将对数生长期的乳腺癌细胞接种到6孔板中，待细胞密度达到50%-60%时，进行慢病毒感

染。在感染过程中，加入终浓度为5pg/mL的聚凝胺(Polybrene)以提高感染效率。感染

24小时后，更换为新鲜的完全培养基继续培养。48小时后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋

白(GFP)的表达情况，以评估感染效率。感染成功的细胞用含有喋吟霉素的培养基进行筛

选，浓度为2-4pg/mL,持续筛选7-10天，直至未感染的细胞全部死亡，获得稳定敲低

miR-1254表达的乳腺癌细胞株。

通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证miR-1254的敲低效果。提取稳定转染细胞

和对照细胞的总RNA,使用miR-1254特异性弓|物和内参U6弓I物进行逆转录反应，合成

cDNA。然后，以cDNA为模板，进行qRT-PCR扩增，反应体系和条件按照SYBRGreen

PCRMasterMix试剂盒说明书进行设置。通过比较目的基因miR-1254与内参基因U6的

Ct值，采用2-AACt法计算miR7254的相对表达量。结果显示，与对照组相比，稳定敲低

miR-1254表达的乳腺癌细胞株中miR-1254的表达水平显著降低，表明miR-1254表达

缺失模型构建成功，可用于后续的细胞功能实验研究。

3.2miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞增殖的影响

3.2.1细胞增殖实验结果分析

为了深入探究miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞增殖的影响，本研究采用了细胞计数试剂盒-

8(CCK-8)实验和5•乙快基・2'-脱氧尿喀嚏核音(EdU)掺入实验。在CCK-8实验中，

将稳定敲低miR-1254表达的乳腺癌细胞(如MDA-MB-231、MCF-7细胞)和对照组细胞分

别接种于96孔板中，每组设置多个复孔。在接种后的第1、2、3、4、5天，向每孔加入10

pLCCK-8试剂，继续孵育1-4小时，使CCK-8试剂与细胞内的线粒体脱氢酶反应生成具有

颜色的甲月赞产物。然后，使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度(OD值)，OD值

的大小与活细胞数量成正比，通过比较不同时间点两组细胞的OD值，可评估细胞的增殖能

力。

实验结果显示，与对照组相比，miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞在接种后的第2天开始，

OD值明显升高，且随着培养时间的延长，这种差异愈发显著。在第5天，MDA-MB-231细

胞中，miH・1254敲低组的OD值为1.85±0.12,而对照组的。D值为1.26±0.09,差异具有

统计学意义(Pv0.01)；MCF-7细胞中，miR-1254敲低组的OD值为1.68±0.10,对照组的

OD值为1.12±0.08,差异同样具有统计学意义(P<0.01)o这表明miR-1254表达缺失能够

显著促进乳腺癌细胞的增殖。

EdU掺入实验则进一步直观地验证了上述结果。EdU是一种胸腺噎嚏核昔类似物，能够在细

胞DNA合成期(S期)掺入到新合成的DNA中。将miR-1254敲低组和对照组的乳腺癌细

胞接种于24孔板中，培养24小时后，加入EdU工作液继续孵育2小时，使正在进行DNA

合成的细胞掺入EdU。然后，按照EdU检测试剂盒的操作步噱，对细胞进行固定、通透、染

色等处理，使用荧光显微镜观察并拍照。在荧光显微镜下，掺入EdU的细胞会发出绿色荧

光，而细胞核则被DAPI染成蓝色。通过计算EdU阳性细胞（绿色荧光细胞）占总组胞（蓝

色荧光细胞）的比例，可评怙细胞的增殖活性。

结果显示，miR-1254敲低组的乳腺癌细胞中EdU阳性组胞比例明显高于对照组。在MDA-

MB-231细胞中，miR-1254敲低组的EdU阳性细胞比例为45.6%±3.2%,对照组为

28.5%±2.5%,差异具有统计学意义（P<0.01）；在MCF-7细胞中，miR-1254敲低组的

EdU阳性细胞比例为40.8%±2.8%,对照组为22.6%±2.0%,差异也具有统计学意义

（P<0.01）。这些结果充分表明，miR-1254表达缺失能够显著增强乳腺癌细胞的增殖能

力，促进细胞的DNA合成和细胞分裂。

3.2.2相关机制探讨

miR-1254表达缺失促进乳腺癌细胞增殖的机制可能与细胞周期调控和相关信号通路的异常激

活密切相关。细胞周期的正常调控是维持细胞稳态和增殖平衡的关键，细胞周期受到多种细胞

周期调控因子的精密调控，包括细胞周期蛋白（Cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶

（CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）等。在乳腺癌细胞中，miR-1254表达

缺失可能通过调控这些细胞周期调控因子的表达，从而影响细胞周期进程，促进细胞增殖。

研究发现,miR-1254可以直接靶向作用于细胞周期蛋白D1（CyclinDI）的mRNA3'・UTR

区域。通过荧光素酶报告基因实验验证，将含有CyclinDI3-UTR野生型序列的荧光素酶报

告载体与miR-1254mimic共转染至乳腺癌细胞中，结果显示荧光素酶活性显著降低，表明

miR-1254能够与CyclinDI3-UTR特异性结合，抑制其翻译过程。在miR-1254表达缺失

的乳腺癌细胞中，由于失去了miR-1254对CyclinDI的抑制作用，CyclinD1的表达水平显

著上调。CyclinD1是细胞周期G1期向S期转换的关键调控因子，其过表达会导致细胞周期

进程加速，促使更多的细胞进入S期进行DNA合成，从而促进乳腺癌细胞的增殖。

miR-1254表达缺失还可能通过激活PI3K/AKT信号通路来促进乳腺癌细胞增殖。PI3K/AKT

信号通路在细胞的生长、增殖、存活等过程中发挥重要作用，该信号通路的异常激活与多种肿

瘤的发生发展密切相关。在正常情况下，miR-1254可以通过靶向调控PI3K/AKT信号通路中

的关键分子，抑制该信号通路的活性。然而，当miR-1254表达缺失时，PI3K/AKT信号通路

被激活，AKT蛋白发生磷酸化，激活的p-AKT进一步磷酸化下游的底物，如哺乳动物雷帕霉

素靶蛋白（mTOR）等。mTOR是细胞生长和代谢的关键调节因子，被激活后会促进蛋白质

合成、细胞周期进程和细胞增殖。通过Westernblot检测发现，在miR-1254敲低的乳腺癌

细胞中，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显升高，而总蛋白水平无明显变化，进一步证

实了miR-1254表达缺失对PI3K/AKT信号通路的激活作用。综上所述，miR-1254表达缺失

通过调控细胞周期调控因子和激活PI3K/AKT信号通路，促进乳腺癌细胞的增殖，在乳腺癌的

发生发展过程中发挥重要作用。

3.3miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

3.3.1Transwell等实验结果呈现

为了深入探究miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，本研究运用了

Transwell小室实验和划痕愈合实验。在Transwell小室实验中，选用无基质胶的小室来检测

细胞迁移能力，将miR-1254敲低组和对照组的乳腺癌细胞(如MDA-MB-231、MCF-7细

胞)分别接种于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化因子。

经过一定时间的孵育后，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，然后将迁移到下室膜表面的细胞

进行固定、染色。在显微镜下随机选取多个视野进行细胞计数，通过比较两组细胞的迁移数

量来评估细胞的迁移能力。

实验结果显示，miR-1254敲低组的乳腺癌细胞迁移到下室的数量明显多于对照组。在MDA-

MB-231细胞中，miR-1254敲低组迁移细胞数量为325±25个，对照组为156±18个.差异

具有统计学意义(P<0.01)；在MCF-7细胞中，miR-1254敲低组迁移细胞数量为287±22

个，对照组为123±15个，差异同样具有统计学意义(P<0.01)。这表明miR-1254表达缺

失能够显著增强乳腺癌细胞的迁移能力。

为检测细胞侵袭能力，在Transwell小室的上室预先铺一层基质胶，其他步骤与迁移实验类

似。基质胶模拟了细胞外基质，只有具有侵袭能力的细胞才能降解基质胶并穿过小室膜。实

验结果表明，miR-1254敲低组的乳腺癌细胞侵袭到下室的数量显著高于对照组。在MDA-

MB-231细胞中，miR-1254敲低组侵袭细胞数量为212±18个，对照组为85±12个，差异具

有统计学意义(P<0.01)；在1\/^47细胞中，miR-1254敲低组侵袭细胞数量为178±15

个，对照组为62±10个，差异也具有统计学意义(P<0.01)。这充分说明miR-1254表达缺

失能够明显提高乳腺癌细胞的侵袭能力。

划痕愈合实验也进一步验证了上述结果。将miR-1254敲低组和对照组的乳腺癌细胞接种于6

孔板中，待细胞融合至90%以上时，用无菌枪头在细胞单层上垂直划痕。划痕后用PBS冲

洗细胞，去除划下的细胞，然后加入无血清培养基继续培养。在划痕后的0、24、48小时分

别在显微镜下拍照，测量划痕宽度，并计算细胞迁移率，迁移率=(0小时划痕宽度•各时间

点划痕宽度)/0小时划痕宽度x100%。实验结果显示，miR-1254敲低组的乳腺癌细胞在划

痕后的24小时和48小时，划痕宽度明显小于对照组，迁移率显著高于对照组。在MDA-MB-

231细胞中，划痕48小时后，miR-1254敲低组的迁移率为75.6%±4.2%,对照组为

42.3%±3.5%,差异具有统计学意义(P<0.01)；在1\4。47细胞中，miR-1254敲低组的迁

移率为68.5%±3.8%,对照组为35.2%±3.0%,差异同样具有统计学意义(P<0.01)0这些

结果一致表明，miR-1254表达缺失能够显著增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，使乳腺癌细

胞更容易突破组织屏障，发生转移。

3.3.2影响细胞迁移和侵袭的分子机制分析

miR-1254表达缺失增强乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制较为复杂，主要与细胞外基质

降解和上皮间质转化(EMT)过程密切相关。细胞外基质是细胞生存和迁移的重要环境，癌

细胞需要降解细胞外基质中的成分，如胶原蛋白、纤连蛋白等，才能实现迁移和侵袭。基质

金属蛋白酶(MMPs)是一类能够降解细胞外基质的锌离子依赖性内肽酶，在肿瘤细胞的侵袭

和转移过程中发挥关键作用。研究发现，miR-1254可以直接靶向作用于MMP-2和MMP-9

的mRNA3-UTR区域。通过荧光素酶报告基因实验验证，将含有MMP-2或MMP-93-UTR

野生型序列的荧光素酶报告载体与miR-1254mimic共转染至乳腺癌细胞中，结果显示荧光素

酶活性显著降低，表明miR-1254能够与MMP-2和MMP-93-UTR特异性结合，抑制其翻译

过程。在miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞中，由于失去了miR-1254对MMP-2和MMP-9

的抑制作用，MMP-2和MMP-9的表达水平显著上调。MMP-2和MMP-9可以降解细胞外基

质中的胶原蛋白和其他成分，为癌细胞的迁移和侵袭开辟通道。通过Westernblot检测发

现，在miR-1254敲低的乳腺癌细胞中，MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平明显升高.进一

步证实了miR-1254表达缺失对MMP-2和MMP-9表达的调控作用。

上皮间质转化是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下转化为具有间质细胞特性的过程，这一

过程赋予上皮细胞更强的迁移和侵袭能力。在EMT过程中，上皮细胞的标志性蛋白E•钙黏

蛋白（E-cadhe而）表达下调，而间质细胞的标志性蛋白如波形蛋白（Vimentin）.N-钙黏

蛋白（N-cadherin）等表达上调。研究表明，miR-1254表达缺失能够通过调控相关信号通

路，促进乳腺癌细胞发生EMT。miR-1254可以靶向抑制Snail、Slug等EMT转录因子的表

达。Snail和Slug是EMT过程中的关键调控因子，它们能够与E-cadherin基因启动子区域

的E-box序列结合，抑制E-cadherin的转录，从而促进EMT的发生。通过荧光素酶报告基

因实验和Westernblot检测发现，miR-1254能够直接作用于Snail和Slug的mRNA3'-UTR

区域，抑制其表达。在miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞中，Snail和Slug的表达水平显著

升高，导致E-cadherin表达下调，Vimentin和N-cadherin表达上调，促进了乳腺癌细胞的

EMT过程，进而增强了细胞的迁移和侵袭能力。此外，miR-1254表达缺失还可能通过激活

PI3K/AKT、Wnt/0-catenin等信号通路，间接调控EMT相关蛋白的表达，促进乳腺癌细胞的

迁移和侵袭。PI3K/AKT信号通路激活后，能够磷酸化下游的多种底物，包括GSK-3B等。

磷酸化的GSK-3B失去活性.无法降解（3-catenin,导致p-catenin在细胞内积累并讲入细胞

核，与TCF/LEF家族转录因子结合，激活EMT相关基因的表达。Wnt/%catenin信号通路的

激活也能够促进EMT过程，使乳腺癌细胞获得更强的迁移和侵袭能力。综上所述，niR-

1254表达缺失通过调控细胞外基质降解和上皮间质转化过程，增强乳腺癌细胞的迁移和侵袭

能力，在乳腺癌的转移过程中发挥重要作用。

3.4miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞凋亡的影响

3.4.1细胞凋亡检测结果

为深入探究miR-1254表达缺失对乳腺癌细胞凋亡的影响，本研究采用AnnexinV-FITC/PI双

染法结合流式细胞术进行检测。将稳定敲低miR-1254表达的乳腺癌细胞（如MDA-MB-

231、MCF-7细胞）和对照组细胞分别接种于6孔板中，培养至对数生长期。收集细胞，用

预冷的PBS洗涤两次，然后按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行操作，将

细胞重悬于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分钟。随

后，使用流式细胞仪进行检测，通过分析AnnexinV-FITC和PI双染的荧光信号，将细胞分

为四个象限：AnnexinV-/PI-为活细胞，AnnexinV+/PI-为早期凋亡细胞，AnnexinV+/PI+

为晚期凋亡细胞，AnnexinV-/PI+为坏死细胞。实验结果以早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞之

和占总细胞的比例作为细胞凋亡率。

实验结果显示，与对照组相比，miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞凋亡率显著降低。在MDA-

MB-231细胞中，miR-1254敲低组的凋亡率为12.5%±2.1%,而对照组的凋亡率为

28.6%±3.5%,差异具有统计学意义(P<0.01)；在MCF-7细胞中，miR-1254敲低组的凋

亡率为10.8%±1.8%,对照组的凋亡率为25.3%±3.0%,差异同样具有统计学意义

(P<0.01)。这表明miR-1254表达缺失能够抑制乳腺癌细胞的凋亡，使癌细胞逃避机体的

凋亡调控机制，从而有利于肿瘤细胞的存活和增殖。为进一步验证上述结果，本研究还采用

了TUNEL(Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling)实验。

TUNEL实验是一种检测细胞凋亡的常用方法，其原理是利用末端脱氧核甘酸转移酶(TdT)

将生物素或地高辛标记的dUTP连接到凋亡细胞断裂的DNA3'-0H末端，然后通过荧光素或

酶标记的亲和素进行检测，在荧光显微镜下观察，凋亡细胞会呈现出绿色荧光。将miR-1254

敲低组和对照组的乳腺癌细胞接种于24孔板中，培养至合适密度后，按照TUNEL试剂盒的

操作步骤进行染色。结果显示，miR-1254敲低组的乳腺癌细胞中TUNEL阳性细胞(绿色荧

光细胞)的比例明显低于对照组，进一步证实了miR-1254表达缺失能够抑制乳腺癌细胞的凋

亡。

3.4.2凋亡相关信号通路的研究

miR-1254表达缺失抑制乳腺癌细胞凋亡的机制与Bcl-2家族、Caspase等凋亡相关蛋白和信

号通路密切相关。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡调控的关键分子，包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、

Bcl-xL等)和促凋亡蛋白(如Bax、Bak等)，它们通过形成同源或异源二聚体来调节线粒

体膜的通透性，从而决定细胞是否进入凋亡程序。研究发现，miR-1254可以直接靶向作用于

Bcl-2的mRNA3'-UTR区域。通过荧光素酶报告基囚实验验证，将含有Bcl-23'-UTR野生型

序列的荧光素酶报告载体与miR-1254mimic共转染至乳腺癌细胞中，结果显示荧光素酶活性

显著降低，表明miR-1254能够与Bcl-23'-UTR特异性结合,抑制其翻译过程。在miR-

1254表达缺失的乳腺癌细胞中，由于失去了miR-1254对Bcl-2的抑制作用，Bcl-2的表达水

平显著上调。Bcl-2可以通过阻止线粒体释放细胞色素C等凋亡因子，抑制Caspase级联反

应的激活，从而发挥抗凋亡作用。通过Westernblot检测发现，在miR-1254敲低的乳腺癌

细胞中，Bcl-2的蛋白表达水平明显升高，而Bax的表达水平无明显变化或略有下降，导致

Bcl-2/Bax比值升高，使得细胞凋亡受到抑制。

Caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中发挥核心作用，可分为启动型

Caspase(如Caspase-8、Caspase-9等)和效应型Caspase(如Caspase-3、Caspase-7

等)。在细胞凋亡信号的刺激下，启动型Caspase被激活，进而激活效应型Caspase,最终

导致细胞凋亡相关底物的降解，引发细胞凋亡。研究表明，miR-1254表达缺失会影响

Caspase信号通路的激活。在miR-1254敲低的乳腺癌细胞中，Caspase-3.Caspase-9的

活性明显降低，其剪切形式(cleavedCaspase-3scleavedCaspase-9)的表达水平显著下

降。这是因为miR-1254表达缺失导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，Bcl-2可以抑制线粒体释

放细胞色素C,细胞色素C是激活Caspase9的美键因子，Caspase9的激活受阻进而无法

激活下游的Caspase-3,使得细胞凋亡相关的级联反应无法正常进行，从而抑制了乳腺癌细

胞的凋亡。此外，miR-1254表达缺失还可能通过其他信号通路间接影响乳腺癌细胞的凋

亡。例如，miR-1254表达缺失可能激活PI3K/AKT信号通路，AKT可以通过磷酸化多种凋

亡相关蛋白，如Bad、FoxO等，抑制它们的促凋亡功能，从而促进细胞存活和抑制细胞凋

亡。综上所述，miR-1254表达缺失通过调控Bcl-2家族蛋白和Caspase信号通路等凋亡相

关机制，抑制乳腺癌细胞的凋亡，在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。

四、miR-1254表达缺失与乳腺癌肿瘤微环境的交互作用

4.1肿瘤微环境概述

肿瘤微环境(TumorMicroenvironment.TME)是指肿瘤细胞所处的局部环境，它并非是肿

瘤细胞的简单堆积，而是一个由多种细胞、细胞外基质(ECM)以及多种生物活性分子共同

构成的复杂且动态变化的生态系统。在这个系统中，细胞成分丰富多样，主要包括肿瘤相关成

纤维细胞(CAFs)、免疫细胞、内皮细胞、周细胞等，它们与肿瘤细胞之间存在着广泛而紧

密的相互作用。

肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中数量众多且功能重要的细胞成分之一。它起源于多种细胞

类型，如成纤维细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞以及间充质干细胞等，在肿瘤细胞分泌的各种细

胞因子和生长因子的刺激下，被激活并发生表型和功能的改变。CAFs能够分泌大量的细胞

外基质成分，如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等，这些成分不仅为肿瘤细胞提供物理支

撑，还通过与肿瘤细胞表面的整合素等受体相互作用，影响肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能

力。CAFs还能分泌多种生长因子，如转化生长因子f(TGF-B)、血小板衍生生长因子

(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等，这些生长因子可以通过旁分泌的方式作用于肿

瘤细胞，激活肿瘤细胞内的相关信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移。

免疫细胞在肿瘤微环境中也扮演着关键角色，包括巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然

杀伤细胞(NK细胞)、树突状细胞(DC)和髓源性抑制细胞(MDSC)等，它们在肿瘤的

发生、发展和免疫逃逸过程中发挥着复杂而多样的作用。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中

浸润的主要免疫细胞之一，根据其表型和功能的不同，可分为M1型和M2型。M1型巨噬细

胞具有较强的抗肿瘤活性，能够分泌多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-a)、白

细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，激活T淋巴细胞等免疫细胞，增强机体的

抗肿瘤免疫反应。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞分泌的各种细胞因子和趋化因子会诱导巨噬细

胞向M2型极化。M2型巨噬细胞则具有免疫抑制功能，它能分泌白细胞介素-10(IL-

10),转化生长因子-B(TGF-P)等免疫抑制性细胞因子，抑制T淋巴细胞、NK细胞等免

疫细胞的活性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸和肿瘤的生长、转移。T淋巴细胞是适应性免疫的

重要组成部分，其中CD8+细胞毒性丁淋巴细胞(CTL)能够识别并杀伤肿瘤细胞，是机体

抗肿瘤免疫的主要效应细胞之一。然而，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可以通过多种机制抑制

CD8+T细胞的活性，如表达程序性死亡配体1(PD-L1),与CD8+T细胞表面的程序性死亡

受体1(PD-1)结合，抑制CD8+T细胞的活化和增殖，导致肿瘤细胞逃避CD8+T细胞的杀

伤。调节性T细胞(Treg)是一类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群，它能分泌IL-10、

TGF-B等抑制性细胞因子，抑制效应T细胞的活性，在肿瘤微环境中，Treg细胞的增多会削

弱机体的抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的发生和发展。

内皮细胞和周细胞参与肿瘤血管的形成，肿瘤血管为肿瘤细胞提供营养物质和氧气，并带走代

谢废物，对肿瘤的生长和转移至关重要。肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子(VEGF)等促血

管生成因子能够刺激内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，促进肿瘤血管的生成。周细胞则围绕

在内皮细胞周围，与内皮细胞相互作用，维持肿瘤血管的稳定性和功能。肿瘤血管的结构和

功能异常，如血管形态不规则、血管壁通透性增加等，不仅影响肿漉细胞的营养供应和代谢，

还使得肿瘤细胞更容易进入血液循环，发生远处转移。

细胞外基质是肿瘤微环境的重要组成部分，主要由胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋

白等大分子物质组成。它不仅为肿瘤细胞提供物理支撑和结构框架，还通过与肿瘤细胞表面

的受体相互作用，调节肿瘤细胞的生物学行为。细胞外基质中的各种成分可以被基质金属蛋

白酶(MMPs)等蛋白酶降解，这些蛋白酶的活性改变会影响细胞外基质的结构和功能，进而

影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞和基质细胞分泌的MIVPs增

多，导致细胞外基质降解，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。细胞外基质还可以储存和释

放多种生长因子和细胞因子，如TGFf、FGF等，这些因子在肿瘤细胞的增殖、分化和转移

过程中发挥重要的调节作用。

肿瘤微环境中的各种生物活性分子，如细胞因子、趋化因子、生长因子和代谢产物等，在肿瘤

细胞与微环境细胞之间的通讯和相互作用中起着关键的介导作用。细胞因子和趋化因子可以

调节免疫细胞的募集、活化和功能，影响肿瘤的免疫微环境。生长因子则能够促进肿瘤细胞

和微环境细胞的增殖、存活和迁移。肿瘤细胞的代谢产物，如乳酸、腺甘等，会改变肿瘤微

环境的酸碱度和代谢状态，影响肿瘤细胞和免疫细胞的功能。肿瘤细胞在无氧代谢过程中产

生大量的乳酸，导致肿瘤微环境呈酸性，这种酸性环境不仅有利于肿瘤细胞的生存和转移，还

能抑制免疫细胞的活性，促进肿瘤的免疫逃逸。

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中发挥着至关重要的作用，它与肿瘤细胞之

间形成了一个相互依存、相互促进的复杂网络。深入了解肿瘤微环境的组成和功能，以及它

与肿瘤细胞之间的相互作用机制，对于揭示肿瘤的发病机制、开发新的肿瘤治疗策略具有重要

的意义。

4.2miR-1254表达缺失对肿瘤微环境中免疫细胞的影响

4.2.1免疫细胞浸润情况分析

miR-1254表达缺失对肿瘤微环境中免疫细胞浸润的影响是多方面且复杂的，对T细胞、巨噬

细胞等免疫细胞的浸润具有显著作用。T细胞作为免疫系统的核心组成部分，在肿瘤免疫监视

和杀伤肿瘤细胞过程中发挥关键作用。研究表明，miR-1254表达缺失会导致肿瘤微环境中T

细胞浸润减少。在乳腺癌动物模型中，通过敲低miR-1254表达后发现，肿瘤组织内CD8+T

细胞的数量明显降低，而CD4+T细胞中调节性T细胞(Treg)的比例相对增加。CD8+T细

胞是重要的细胞毒性T细胞，能够直接识别并杀伤肿瘤组胞，其浸润戒少使得肿瘤细胞逃避

机体免疫监视的能力增强，有利于肿瘤的生长和发展。而Treg细胞则具有免疫抑制功能，能

够分泌白细胞介素・10(IL-10)、转化生长因子f(TGF-p)等抑制性细胞因子，抑制效应

T细胞的活性，Treg细胞比例的增加进一步削弱了机体的抗肿瘤免疫反应。

巨噬细胞是肿瘤微环境中另一类重要的免疫细胞，根据其功能和表型可分为M1型和M2

型。M1型巨噬细胞具有促炎和抗肿瘤活性，能够分泌肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介

素-1(IL-1)等细胞因子，激活T细胞等免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应。M2型巨

噬细胞则具有免疫抑制和促肿瘤作用，能分泌IL-10、TGF-0等细胞因子，促进肿瘤细胞的增

殖、血管生成和转移。研究发现，miR-1254表达缺失会促进巨噬细胞向M2型极化。在体

外实验中，将miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞与巨噬细胞共培养，结果显示巨噬细胞中M2

型巨噬细胞标志物CD206、精氨酸酶-1(Arg-1)的表达显著上调，而M1型巨噬细抱标志

物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达明显下调。这表明miR-1254表达缺失能够改变巨噬

细胞的极化状态，使其向具有免疫抑制功能的M2型巨噬细胞转变，从而营造有利于肿瘤生长

和转移的免疫微环境。此外，miR-1254表达缺失还可能影响其他免疫细胞的浸润，如自然杀

伤细胞(NK细胞)等。NK细胞是固有免疫的重要效应细胞，能够直接杀伤肿瘤细胞，无需

预先接触抗原。研究显示，miR-1254表达缺失可能导致肿瘤微环境中NK细胞的活性和浸润

数量降低，使得机体对肿瘤细胞的天然免疫防御能力下降。通过对乳腺癌患者肿瘤组织的免

疫组化分析发现，miR-1254表达水平较低的肿瘤组织中，NK细胞的浸润程度明显低于miR-

1254表达正常的组织。综上所述，miR-1254表达缺失通过影响多种免疫细胞的浸润和功能

状态，改变肿瘤微环境的免疫格局，促进乳腺癌的发生、发展和转移。

4.2.2免疫调节相关机制研究

miR-1254表达缺失对免疫组胞功能和免疫逃逸的影响涉及多种复杂的分子机制。miR-1254

表达缺失会通过调节免疫细胞表面的共刺激分子和共抑制分子的表达，影响免疫细胞的活化和

功能。在T细胞中，共刺激分子如CD28、CD40L等对于T细胞的活化和增殖至关重要，共

抑制分子如程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等则能

够抑制T细胞的活性，防止过度免疫反应。研究表明，miR-1254表达缺失会导致T细胞表

面PD-1和CTLA-4的表达二调。在乳腺癌细胞与T细胞的共培养体系中，敲低miR-1254

表达后，T细胞表面PD-1和CTLA-4的蛋白水平显著升高，而CD28的表达则无明显变化或

略有下降。PD-1和CTLA-4与相应配体结合后，会抑制T细胞的活化、增殖和细胞毒性，使

得T细胞无法有效杀伤肿瘤细胞，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。miR-1254表达缺失还可

能通过调节免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子，影响肿瘤微环境的免疫调节功能。细胞因

子和趋化因子在免疫细胞的募集、活化和功能调节中发挥重要作用。如前所述，miR-1254表

达缺失会促使巨噬细胞向M2型极化，M2型巨噬细胞分泌的IL-10、TGFf等免疫抑制性细

胞因子增多。IL-10能够抑制T细胞、NK细胞等免疫细抱的活性，降低它们对肿瘤细胞的杀

伤能力；TGFf不仅可以抑制免疫细胞的功能，还能促进肿瘤细胞的上皮间质转化

(EMT),增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。此外，miR-1254表达缺失可能导致肿瘤细胞分

泌的趋化因子改变，影响免疫细胞的募集。肿瘤细胞分泌的趋化因子如CCL2、CCL5等可以

吸引免疫细胞向肿瘤组织浸润。研究发现，miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞分泌的CCL2增

多，CCL2能够招募单核细胞和Treg细胞进入肿瘤微环境。单核细胞在肿瘤微环境中可分化

为巨噬细胞，在CCL2等因子的作用下更倾向于向M2型巨噬细胞极化，而Treg细胞的增多

则进一步抑制了机体的抗肿瘤免疫反应。

miR-1254表达缺失还可能通过影响肿瘤细胞的抗原呈递过程，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。肿

瘤细胞需要将肿瘤抗原呈递给T细胞，才能激活T细胞的抗肿瘤免疫反应。抗原呈递过程涉

及肿瘤细胞摄取、加工抗原，然后将抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，呈

递到细胞表面。研究表明，miR-1254表达缺失可能导致肿瘤细胞中MHC分子的表达下调，

影响抗原呈递。在乳腺癌细胞中，敲低miR-1254表达后，MHCI类分子的表达水平明显降

低，使得肿瘤细胞无法有效地将肿瘤抗原呈递给CD8+T细胞，从而使肿瘤细胞逃避CD8+T

细胞的识别和杀伤。此外，miR-1254表达缺失还可能影响肿瘤细胞中抗原加工相关分子的表

达，如蛋白酶体亚基、抗原加工转运体(TAP)等，进一步干扰抗原呈递过程。综上所述，

miR-1254表达缺失通过多种机制影响免疫细胞的功能和肿瘤细胞的免疫逃逸，破坏机体的抗

肿瘤免疫平衡，在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要作用。

4.3miR-1254表达缺失对肿瘤微环境中血管生成的影响

4.3.1血管生成相关实验结果

为探究miR-1254表达缺失对肿瘤微环境中血管生成的影响，本研究开展了一系列体内外实

验。在体外，采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管实验，将miR-1254敲低的乳腺癌细胞

培养上清液(条件培养基)与HUVEC共培养，以正常表达miR-1254的乳腺癌细胞培养上清

液作为对照。实验结果显示，与对照组相比，miR-1254敲低组乳腺癌细胞条件培养基处理的

HUVEC形成的管腔结构数量明显增多，管腔长度更长且分支更复杂。在相同视野下，对照

组HUVEC形成的管腔数量平均为15.6±2.5个，而miR-1254敲低组为25.8±3.2个，差异具

有统计学意义(P<0.01)。这表明miR-1254表达缺失的乳腺癌细胞能够分泌更多促进血管

生成的因子，增强HUVEC的成管能力，促进血管生成。

在体内，构建乳腺癌原位移植瘤模型，分别接种miR-1254敲低和正常表达的乳腺癌细胞。

在肿瘤生长一定时间后，对肿瘤组织进行免疫组化染色，检测血管内皮标志物CD31的表

达，以评估肿瘤血管生成情况。结果显示，miR-1254敲低组肿瘤组织中CD31阳性血管的密

度显著高于对照组。通过图像分析软件测量，miR-1254敲低组肿瘤组织中CD31阳性血管面

积占肿瘤总面积的百分比为35.6%±4.2%,而对照组为20.8%±3.5%,差异具有统计学意义

(P<0.01)。这进一步证实了miR-1254表达缺失能够促进肿瘤组织内血管生成，为肿瘤细

胞提供更多的营养物质和氧气供应，有利于肿瘤的生长和转移。

4.3.2血管生成相关因子和信号通路分析

miR-1254表达缺失促进肿瘤血管生成与多种血管生成相关因子和信号通路密切相关，其中血

管内皮生长因子(VEGF)是关键的促血管生成因子之一。研究发现，miR-1254可以直接靶

向作用于VEGF的mRNA3'-UTR区域。通过荧光素酶报告基因实验验证，将含有VEGF