宏基因组测序临床实验室规范化指南2026

宏基因组测序临床实验室规范化指南01020304实验室建设要求检测流程管理结果判读与质量控制支持体系与性能确认CONTENTS目录实验室建设要求010203明确临床预期用途mNGS检测项目需明确针对的疾病类型或症候群、适用人群及标本类型，确保检测与临床需求紧密关联，为精准诊疗提供依据。预期用途应说明检测的病原体核酸类型（DNA、RNA或两者），并阐述其临床意义，如辅助诊断、补充病原学证据，以指导临床合理应用。预期用途需涵盖标本类型、适用人群等关键信息，确保检测流程标准化，提升结果可靠性，并为实验室质量控制和结果解读奠定基础。明确检测项目的临床适用范围规定核酸类型与临床意义确保检测信息的完整性与规范性实验室功能分区设置实验流程单向流动与物品专用环境清洁与区域共用管理实验室应根据mNGS项目数量、技术流程和工作量进行分区，必须设置试剂准备区、标本制备区、文库制备区、文库扩增区（如适用）和测序区，并保证充分有效通风，以降低环境微生物和扩增产物污染风险。实验室工作必须按试剂准备区、标本制备区、文库制备区、文库扩增区和测序区单一流向进行，各区物品专用，包括试剂耗材、可移动设备及个人防护用品，避免交叉污染。实验前后需使用季铵盐类或含氯消毒剂进行清洁，并建立外来人员准入制度。不推荐与常规分子检测（如PCR）共用区域，如必须共用，则需严格遵循mNGS实验室的分区管理与清洁程序。分区设置与污染控制人员资质与培训要求人员组成与岗位分工上岗培训与资质认证持续能力评估与岗位适配mNGS实验室人员应至少包括实验室负责人、“湿实验”操作人员、“干实验”分析人员及结果报告人员，确保各环节有专人负责，保障检测流程的专业性与完整性。人员必须参加省级以上卫生行政部门指定机构组织的技术培训，并完成内部制度化培训与考核，确认能力达标后方可上岗，确保操作规范与结果可靠性。实验室需配备符合指南要求能力的人员，并通过持续培训与考核确保其技能与知识更新，以适应mNGS技术发展及临床检测需求的变化。检测流程管理010203标本采集的污染控制要求标本运输与包装的规范标本接收、保存与质检程序指南强调采集应在洁净区域进行，使用无菌且经过去核酸处理的采集管与工具。操作人员需做好防护，严格无菌操作，采集后立即密封并减少暴露时间，以最大限度避免环境、人员或患者体表微生物污染标本。运输需由培训人员负责，包装须符合生物安全要求。每个标本管应使用一次性密封袋独立封装，防止泄漏导致交叉污染。同时需规定运输温度范围与时间限，确保标本在送达前保持稳定。实验室应建立标本接收质检程序，对不合格标本（如量不足、泄漏、超时、溶血等）制定拒收或重采等处理措施。保存条件需明确采集后、送达后及检测前的温度与时间要求，并建立检测后标本留存与销毁流程。标本采集运输保存湿实验流程与质控实验室应根据项目数量、技术流程和工作量进行分区，设置试剂准备区、标本制备区、文库制备区、文库扩增区及测序区，并保证有效通风。工作须按单一流向进行，各区物品专用，以降低污染风险。湿实验流程需制定SOP，涵盖去宿主核酸、核酸提取等环节。对不同标本（如无菌与有菌标本）应在不同区域或批次处理，并建立质量值监测，包括核酸浓度、片段大小等关键指标。测序区需保持温湿度稳定，避免震动。文库制备包括片段化、加接头等步骤，需监测文库浓度与片段大小。实验前后应严格执行清洁程序，使用带滤芯吸头，防止交叉污染。实验室分区与单向工作流标本处理与核酸提取质控测序与文库构建要求010203原始数据质控包括样本拆分、接头去除和数据过滤等步骤。实验室需明确过滤低质量数据、重复序列等类型，并建立测序数据量、有效数据量及碱基质量值（如Q30）等下机数据的质量要求，常用工具包括FastQC、fastp等。宿主序列过滤指去除人源序列，通常使用Bowtie2、BWA等软件比对人类基因组参考数据库。实验室应明确所用数据库版本，并设立过滤后有效数据量、非宿主数据占比等质量值，确保后续物种注释的准确性。物种注释通过将非宿主序列与微生物参考数据库比对，在特定相似度阈值下分类微生物。实验室需建立有效序列可注释比例、最小比对相似度等质量值，并选用基于k-mer、BWT等算法的软件进行标准化分析。原始数据质控环节的关键要素宿主序列过滤的操作与质量要求物种注释的方法与质量标准干实验流程与质控结果判读与质量控制阳性判断值的核心作用阳性判断值的建立方法阳性判断值的差异化设定阳性判断值（cut-off值）是区分mNGS检测结果阴性与阳性的关键标准，用于判定病原体核酸的定性结果。基于该值进行结果判读，可形成固定检测流程，确保结果标准化并应用于临床诊疗。实验室可通过收集一定数量的临床标本，利用ROC曲线等方法建立阳性判断值。常用规则包括病原体特异性reads数、RPM（每百万reads数）、覆盖基因组非重叠区域的reads数或RPM-r值等，以实现科学、客观的阈值设定。针对同一mNGS检测项目，实验室需根据病原体类型（如细菌、真菌、病毒）、病原体特征及标本类型（如血液、脑脊液）分别设定阳性判断值。这有助于提高检测的准确性与针对性，减少假阳性或假阴性结果的发生。阳性判断值建立背景微生物数据库的建立目的与来源背景微生物数据库的建立与更新方法背景数据库在结果判读中的应用原则建立背景微生物数据库的核心目的是识别并排除检测全流程中由试剂、环境、耗材等引入的外源微生物污染，确保结果准确性。其来源主要包括试剂批次、实验室环境、耗材及操作过程可能引入的非标本源性微生物核酸。实验室应在临床检测开展前通过空白对照检测建立初始数据库，并在检测中定期更新。当试剂、耗材更换或季节变化可能影响背景微生物时，需重新进行空白对照检测，以补充和修正数据库内容。在结果判读时，实验室需先根据阳性判断值初步判定病原体，再对照背景微生物数据库排除外源引入的微生物或核酸，最终给出仅来源于临床标本的可靠检测结果，避免假阳性。背景数据库建立结果判读原则实验室应建立基于临床标本的阳性判断值，用于定性判定病原体核酸。可通过ROC曲线等方法，针对不同病原体类型、特征及标本类型分别设定。常见规则包括特定reads数、RPM等，检测值高于阈值即判定为检出，但需结合临床排除外源污染。阳性判断值的建立与应用为排除外源污染，实验室需建立覆盖标本采集至检测全过程的背景微生物数据库。通过定期检测空白对照，记录试剂、环境及耗材引入的微生物，并在试剂更换或季节变化时更新数据库，确保结果判读的准确性。背景微生物数据库的构建与更新mNGS结果判读需遵循两步原则：首先依据阳性判断值初步判定病原体检出情况，然后利用背景微生物数据库排除外源引入的微生物或核酸，最终结合临床信息给出检测结果，避免将污染误判为真实感染。结果判读的两步原则支持体系与性能确认010203试剂耗材软件管理试剂制备与耗材使用需严格管控背景微生物污染。每批次试剂均应进行背景微生物确认，耗材需通过高压灭菌或化学处理，并使用带滤芯吸头，以最大限度降低外源核酸干扰。试剂与耗材的背景微生物控制实验室应建立生物信息学分析软件更新流程。更新后需使用至少3个历史数据重新验证关键参数（如物种分类），确保性能不低于更新前，保障分析结果的准确性与一致性。分析软件的更新与验证程序数据库需明确来源、版本及数据纳入标准。更新应谨慎并经过验证，建议使用至少10个涵盖各类病原体的历史数据评估更新影响，避免因序列错误或信息不全导致假性结果。病原微生物数据库的管理要求010302参考物质应具备良好的均匀性、稳定性和互通性，且需含有人源核酸或细胞以及明确浓度的病原体核酸或灭活病原体，以确保其能够真实模拟临床标本的检测条件。用于全过程监测的参考物质需具有与临床标本相同或相近的基质，例如血浆参考物质应考虑游离DNA片段特征的一致性，以保证检测结果的可靠性和可比性。参考物质适用于分析性能确认、室内质控和室间质评；实验室应根据使用目的选择含特定病原体及浓度的参考物质，“干实验”性能确认可使用计算机模拟数据或已验证数据集。参考物质的基本特性要求参考物质的基质与特征适配性参考物质的应用场景与选择原则参考物质使用要求性能确认的基本内容与范围性能确认的具体指标与验证方法性能确认的持续更新与记录要求性能确认应涵盖分析前、分析中与分析后全流程，包括标本采集、核酸提取、文库构建、测序、生物信息学分析及结