UPCC-MSMS测定手性药物LEW-013在Beagle犬血浆中浓度的方法学研究

UPCC-MS/MS测定手性药物LEW-013在Beagle犬血浆中浓度的方法学研究UPCC-MS/MS测定手性药物LEW-013在Beagle犬血浆中浓度的方法学研究【摘要】目的：建立UPCC-MS/MS定量测定Beagle犬血浆中R-LEW-013和S-LEW-013的检测方法，并对该方法进行方法学验证。方法：血浆样品以非那西汀为内标，使用WatersACQUITYUPCCTrefoilTMCEL2为色谱柱（3.0×150mm2.5m），以CO2-甲醇为流动相，流速为1.0ml/min梯度洗脱，进样量为2L。质谱采用电喷雾电源（ESI），正离子模式，多重反应检测。方法学验证的内容包括选择性、标准曲线和定量下限（LLOQ)、残留、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。结果：方法选择性良好，方法标准曲线的范围为10~5000ng/ml，LLOQ为10ng/ml，无残留现象。对于精密度和准确度，S-LEW-013低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为2.70%、2.52%、3.02%；批间准确度RE%值分别为0.20%、-2.84%、-2.61%；R-LEW-013低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为4.92%、2.81%、2.72%；批间准确度RE%值分别为-1.99%、-3.58%、-2.40%。对于基质效应，总体变异系数符合接受标准。对于提取回收率，低、高浓度下S-LEW-013的平均回收率分别为93.61%、102.50%；R-LEW-013的平均回收率分别为102.16%、101.94%；内标非那西汀的平均回收率分别为96.48%、101.75%。对于稳定性，血浆中的S-LEW-013与R-LEW-013在不同环境与温度下检测出的浓度与标示浓度的相对误差（RE%）均符合稳定性的要求。结论：本研究建立的UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013浓度的检测方法符合要求，可用于相关专题生物样品检测。【关键词】方法学验证;生物样品;UPCC-MS/MS;手性药物DeterminationofChiralDrugLEW-013inBeagleDogPlasmabyUPCC-MS/MS[Abstract]Objective:ToestablishanUPCC-MS/MSmethodtodetermineS-LEW-013andR-LEW-013inbeagledogplasma.AndThemethodwasverifiedbymethodology.Methods:PlasmasampleswereseparatedbyaWatersACQUITYUPCCTrefoilTMCEL2column(3mm×150mm,2.5μm)inaflowphaseconsistingofmethanolandCO2-methanolataflowrateof1.0ml/min,withPhenacetinastheinternalstandard.TheESIelectrosprayionizationandpositiveiondetectioninMultipleresponse.Thecontentsofmethodologyvalidationincludeselectivity,standardcurveandlimitofquantification(LLOQ),residue,precisionandaccuracy,matrixeffect,extractionrecoveryandstability.Results：Themethodhadgoodselectivityandhadalinearrelationshipintherangeof10-5000ng/ml.Thelowestquantitativelimitwas10ng/mlandnoresidue.Forprecisionandaccuracy,

TheCV%valuesoflow,middleandhighconcentrationQCsampleswere2.70%,2.52%and3.02%,respectively,andtheinter-batchaccuracyRE%valueswere0.20%,-2.84%and-2.61%,respectively,andtheCV%valuesoflow,middleandhighconcentrationsofS-LEW-013were2.70%,2.52%and3.02%,respectively.PrecisionCV%ofS-LEW-013inlow,mediumandhighconcentrationQCsamples.

4.92%,2.81%,2.72%respectively;inter-batchaccuracyRE%valueswere-1.99%,-3.58%,-2.40%,respectively.Forthematrixeffect,theoverallvariationcoefficientmeettheacceptancecriteria.Fortheextractionrecovery,theaveragerecoveryofS-LEW-013atlowandhighconcentrationswas93.61%and102.50%,respectively.TheaveragerecoveryofR-LEW-013was102.16%and101.94%,respectively.TheaveragerecoveryoftheinternalstandardPhenacetinwas96.48%and101.75%,respectively.Forstability,therelativeerror(RE%)betweentheconcentrationdetectedinplasmaS-LEW-013andR-LEW-013atdifferentenvironmentsandtemperaturesandthelabeledconcentrationmeetstherequirementsofstability.Conclusion:TheestablishedUPCC-MS/MSmethodforthedeterminationofS-LEW-013andR-LEW-013inBeagledogplasmameetstherequirementsandcanbeusedforthedetectionofrelatedspecialbiologicalsamples[Keywords]Methodologicalvalidation;biologicalsample；UPCC-MS/MS；chiraldrug目录TOC\o"1-3"\u引言 引言S-LEW-013是某公司研发的手性药物，是一种质子泵抑制剂，可选择性地作用于胃黏膜壁细胞，抑制壁细胞中H，K-ATP酶的活性，使壁细胞内的H不能转运到胃中，从而抑制胃酸的分泌。LEW-013在弱酸环境中比同类药物更为稳定，被激活后仅与质子泵上活化部位两个位点结合。分子中存在1个手性硫原子中心为1对对映体组成的混合物，此类药物的药效学和药动学表现出对映体的差异性[1~4]。经查阅有关资料，S-LEW-013比LEW-013具有更高的疗效，而R-LEW-013基本没有药物活性，S-LEW-013在beagle犬体内不会向R-LEW-013转化[5~8]。因此，S-LEW-013在体内是否进行异构体转化是该药成药性的关键，我们需同时检测生物样品中R-LEW-013和S-LEW-013的浓度。据近五年的知网文献报道，目前国内最常用的分析S-LEW-013的方法有HPLC法和HPLC/MS-MS法，对手性药物的检测效果都不错[9~15]。而这次试验，我们建立UPCC-MS/MS定量测定Beagle犬血浆中R-LEW-013和S-LEW-013的检测方法，这是国内十分少见的先进方法，为了检验该方法能否进行药代动力学以及毒代动力学试验研究，我们要对该方法进行方法学验证。方法学验证的内容有选择性、标准曲线和定量下限（LLOQ)、残留、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性，每一项内容都必须要符合生物样品定量分析方法验证指导原则的要求[16]。方法学验证是整个实验数据可靠的基本保障，对所建立的生物样品分析方法进行方法学验证是必不可少的一部分。我们要对试验的每一个步骤的操作都要做到严谨准确。1方法原理与意义1.1选择性血浆中存在多种干扰成分，为保证分析方法能够准确、专一地检测到目标化合物，要考察至少6个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加一定浓度对照品色谱图,以反映分析方法对目标峰的选择性。1.2标准曲线和定量下限（LLOQ）为了能够在一定范围内通过仪器响应值来推算物质的浓度，我们需要建立标准曲线，以样品浓度为横坐标，目标化合物的峰面积与内标物峰面积比值Y为纵坐标，做线性回归。用加权最小二乘法计算各回归方程，并要求相关系数R2>0.98。定量下限(LLOQ)是校正曲线上的最低浓度点，需进行精密度和准确度验证。1.3残留样品进样后，有部分样品会残留在系统中，对后面进样的样品产生影响，定量上限后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并不超过内标响应的5%。1.4准确度和精密度准确度是测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。精密度是相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。1.5基质效应因为本次试验使用质谱检测，基质会对药物的检测造成干扰，所以要考察基质效应[8]。1.6稳定性为了让实验数据更加严谨，我们根据药物的具体情况制定稳定性的标准：1.进样器温度下放置24h稳定性；2室温放置6h稳定性；3冻融三次稳定性；4低温冻存1个月、2个月稳定性；5稀释10倍和20倍稳定性。进行稳定性评价以保证样品采集、储存、处理和分析的每一步骤都不能影响样品中分析物的浓度[9]。2.研究材料2.1对照品2.1.1S-LEW-013：规格：0.1g/瓶；保存条件为避光，密封，阴凉处。溶剂及溶解性：在甲醇中易溶，在水中略溶，在三氯甲烷、乙醚中几乎不溶。提供单位：某公司。2.1.2R-LEW-013：规格：200mg/瓶；保存条件为避光，密封，阴凉处。溶剂及溶解性：在甲醇中易溶，在水中略溶，在三氯甲烷、乙醚中几乎不溶。提供单位：某公司。2.1.3非那西丁：含量（浓度）：98.6%；规格：250mg/瓶；保存条件为2~8℃保存：溶剂及溶解性：本品在乙醇或氯仿中溶解，在沸水中略溶，在水中极微溶解。提供单位：某公司。2.2主要试剂2.2.1超纯水：由超纯水混床树脂过滤器制备，符合分析实验室用水一级水的标准。2.2.2甲醇：批号：10917307743，有效期至2020年10月31日，生产厂家为德国默克集团（中国公司）。2.2.2空白血浆：来源于本研究院储备动物中采集的空白血液，肝素钠抗凝制备成空白血浆。2.3主要仪器2.3.1超高效合相色谱质谱联用仪：型号为UPC2-XEVOTQD；厂家为沃特世科技（上海）有限公司。2.3.2多用途高效离心机：型号为AvantiJ-E；厂家为贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。2.3.3电子天平：型号为BSA224S、BT25S，上述天平校准/检定日期为2018年01月05日、2017年09月15日，均为一年检定/校准一次，生产厂家均为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。2.3.4移液器：量程分别为2-20l、20-200l、100-1000l，Brand公司产品。3.试验材料与方法3.1溶液的配制3.1.1S-LEW-013对照品储备的配制使用可读精度至少为十万分之一的电子天平称S-LEW-0130.0054g，先用少量的甲醇溶解，用甲醇：水（1:1）定容至5ml容量瓶中，得浓度约为1mg/ml的S-LEW-013储备液，2-8℃保存。3.1.2R-LEW-013对照品储备液的配制使用可读精度至少为万分之一的电子天平称R-LEW-0130.0060g，先用少量的甲醇溶解，用甲醇：水（1:1）定容至5ml容量瓶中，得浓度约为1mg/ml的R-LEW-013储备液，2-8℃保存。3.1.3内标非那西汀储备液的配制使用可读精度至少为万分之一的电子天平称取非那西汀0.0050g，先用少量的甲醇溶解，用甲醇：水（1:1）定容至5ml容量瓶中，得浓度约为1mg/ml的非那西汀储备液，2-8℃保存。3.1.4稀释液的配制量取甲醇和超纯水，按照1:1的比例，混合摇匀即得。根据需要量合理配制。3.1.5S-LEW-013和R-LEW-013线性工作液的配制分别用移液器移取适量S-LEW-013和R-LEW-013对照品储备液用稀释液配制为系列浓度为100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000ng/ml的S-LEW-013和R-LEW-013混合线性工作液。3.1.6质控（QC）工作液的配制用移液器移分别取S-LEW-013和R-LEW-013对照品储备液用稀释液配制为10、20、200、1600ng/ml的QC混合工作液。3.1.7内标工作液的配制用移液器移取非那西丁对照品储备液用稀释液配制为10g/ml的内标工作液。3.2色谱条件色谱柱：WatersACQUITYUPC2TrefoilTMCEL23.0×150mm2.5m流动相：A为CO2；B为甲醇流速：1.0ml/min流动相比例如下：Time（min）CompositionA（%）CompositionB（%）08119188119进样量：2L备压：1600Psi3.3质谱方法采用电喷雾电源（ESI），正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillary：3.50kv；cone：50V；Desolvationtemperature：500℃；Desolvationgasflow:650L/h；Conegasflow：10L/h。S-LEW-013和R-LEW-013及内标非那西汀的质谱条件如下：通道名称MRM离子对锥孔电压碰撞能量S-LEW-013、R-LEW-013384.07→200.053110非那西汀180.10→109.9917203.4已知血浆样品前处理精密移取空白血浆样品45L，加入混合线性工作液5L（或稀释液5L），再加入5L内标工作液（10g/ml，空白样品加稀释液），加入乙腈150L，涡旋30s，14000r/min离心10min，4℃控温，取上清，再次14000r/min离心10min，4℃控温，取上清至进样瓶。3.5方法学验证过程3.5.1选择性选取6份不同来源的Beagle犬空白血浆样品各45L，除不加内标外，按照“3.4已知血浆样品前处理”项下操作处理后，获得空白血浆样品色谱图；将最低定量浓度（LLOQ）和内标溶液加入Beagle犬空白血浆，依同法操作，获得相应色谱图；要求目标化合物在空白样品中的峰面积不得超过LLOQ样品峰面积的20%，并低于内标响应的5%，即可以接受。3.5.2标准曲线和定量下限（LLOQ）移取Beagle犬空白血浆45L，加入S-LEW-013和R-LEW-013系列混合工作液（100，200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000ng/ml）5L，配制成相当于Beagle犬血浆含S-LEW-013和R-LEW-013浓度为10，20，50，100，200，500，1000，2000、5000ng/ml的样品，按照“3.4已知血浆样品前处理”项下操作处理后，得到工作曲线样品进样分析。以样品浓度X（ng/ml）为横坐标，S-LEW-013和R-LEW-013的峰面积与内标物峰面积比值Y为纵坐标，做线性回归。用加权最小二乘法计算各回归方程，要求相关系数R2>0.98。待测样品中的S-LEW-013和R-LEW-013的浓度由该批次的标准曲线通过内标法计算获得。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内，定量下限处应该在±20%。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。LLOQ：标准曲线上的最低浓度点为LLOQ。LLOQ需进行精密度和准确度验证，要求准确度（相对误差：RE%）不超过±20%，精密度（变异系数：CV%）≤20%。3.5.3残留在定量上限（5000ng/ml）进样后，设置2个空白样品来考察残留。定量上限后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并不超过内标响应的5%。3.5.4准确度和精密度按照“3.4已知血浆样品前处理”项下方法分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、中、高三个浓度（20、2000、4000ng/ml）三个浓度的质控样品（QC），每个批次每个浓度6个样品，获得批内精密度和准确度，由三个分析批的数据获得批间精密度和准确度。QC样品的浓度由该批次的标准曲线确定。批内和批间精密度以变异系数（CV%）表示，CV%=（标准偏差SD/测得浓度平均值）×100%；准确度以相对误差（RE%）表示，RE%=（测得浓度平均值-标示浓度）/标示浓度×100%。批内和批间变异系数（CV%）不得超过15%；批内和批间RE%应在样品标示值的±15%之内。3.5.5基质效应分别取6只Beagle犬空白血浆45L，其余按“14..4已知血浆样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5L和内标溶液5L，涡旋混匀后，进样分析；同时用稀释液代替空白血浆，同法操作后进样分析。比较两种处理方式下目标化合物和内标峰面积比值，计算S-LEW-013和R-LEW-013和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。计算值的总体变异系数不得大于15%。3.5.6提取回收率按照“3.4已知血浆样品前处理”项下方法分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、高浓度（20、4000ng/ml）质控样品（QC），每个浓度6个样品。同时另取Beagle犬空白血浆45L，按“3.4已知血浆样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5L和内标溶液5L，涡旋混匀后，进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算回收率。3.5.7自动进样器温度下放置24h稳定性按“3.4已知血浆样品前处理”项下方法分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、高浓度（20、4000ng/ml）的质控样品（QC），每个浓度配制6个样品，置自动进样器温度下放置24h后，测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差（RE%）评价样品置自动进样器温度下放置稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。3.5.8室温放置6h稳定性按“3.4已知血浆样品前处理”项下方法分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、高浓度（20、4000ng/ml）的质控样品（QC），每个浓度配制6个样品，置室温放置6h后，测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差（RE%）评价样品置自动进样器温度下放置稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。3.5.9冻融三次稳定性配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、高浓度（20、4000ng/ml）的质控样品（QC），每个浓度配制6个样品，冻融三次后，按“3.4已知血浆样品前处理”项下方法前处理后，分别测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差（RE%）评价样品冻融三次稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。3.5.10低温冻存1个月、2个月稳定性分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的低、高浓度（20、4000ng/ml）的质控样品（QC），每个浓度配制6个样品，分别低温冻存1个月、2个月、，按“3.4已知血浆样品前处理”项下方法前处理后，分别测定样品浓度，由测得样品浓度与标示浓度的相对误差（RE）评价样品低温冻存1个月、2个月长期稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内。3.5.11稀释10倍和稀释20倍稳定性分别配制S-LEW-013和R-LEW-013Beagle犬血浆的25g/ml和50g/ml的工作液，每个配制6份样品，采用空白血浆稀释10倍和20倍后前处理进样分析，检测标示浓度均为2500ng/ml.。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15%范围内评价稀释稳定性。4.方法学验证结果与分析4.1选择性结果UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013浓度空白血浆样品色谱图、LLOQ色谱图以及未知样品代表性色谱图见图B1~1-6。空白血浆样品色谱图中目标化合物和内标的保留时间范围内未出现明显的内源性干扰信号，目标化合物S-LEW-013、R-LEW-013和内标非那西汀的峰型良好，可说明该分析方法具有良好的选择性。4.2标准曲线和定量下限（LLOQ）结果UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013浓度的标准曲线的代表图见图B8和图B9，各批次标准曲线见表A1和表A2，线性范围均为10-5000ng/ml，相关系数R2均大于0.98，该分析方法具有良好的线性关系。LLOQ为10ng/ml的精密度和准确度见表A5和附表3-2。UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013的批间CV%值为5.51%，批间RE%值为5.56%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013的批间CV%值为6.38%，批间RE%值为0.16%；符合LLOQ的限度要求。4.3残留在定量上限后，设置空白血浆样品进样考察残留，空白血浆样品的S-LEW-013和R-LEW-013的响应低于定量下限S-LEW-013和R-LEW-013响应值的20%，内标非那西汀的响应低于定量下限内标响应值的5%。4.4精密度与准确度结果如表A3所示，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为2.70%、2.52%、3.02%；批间准确度RE%值分别为0.20%、-2.84%、-2.61%；如附表2-2所示，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为4.92%、2.81%、2.72%；批间准确度RE%值分别为-1.99%、-3.58%、-2.40%；均符合精密度和准确度的限度要求。4.5基质效应结果基质效应验证结果见附表4-1和表A8。UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013在低、高浓度下的目标化合物S-LEW-013的峰面积比值平均值分别为81.75%、87.65%，内标非那西汀的峰面积比值平均值分别为72.24%、74.66%，内标归一化的基质因子平均值分别为1.16和1.20，总体变异系数分别为14.93%和13.96%，符合要求。UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013在低、高浓度下的目标化合物R-LEW-013的峰面积比值平均值分别为80.90%、89.15%，内标归一化的基质因子平均值分别为1.15和1.22，总体变异系数分别为14.66%和13.44%，符合要求。4.6提取回收率结果提取回收率如表A9、5-2和5-3所示，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013在低、高浓度下目标化合物S-LEW-013的平均回收率分别为93.61%、102.50%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013在低、高浓度下目标化合物R-LEW-013的平均回收率分别为102.16%、101.94%；内标非那西汀的平均回收率分别为96.48%、101.75%。4.7进样器温度下放置24h稳定性结果进样器温度下放置24h稳定性结果见表A12和表A13，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、高浓度质控样品在进样器温度下放置24h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-4.58%、6.07%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、高浓度质控样品在进样器温度下放置24h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为7.45%、4.48%；结果表明Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013进样器温度下放置24h的稳定性符合要求。4.8室温放置6h稳定性结果室温放置6h稳定性结果见表A14和表A15，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、高浓度质控样品在室温放置6h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.31%、0.90%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、高浓度质控样品在室温放置6h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.24%、2.55%；结果表明Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013室温放置6h的稳定性符合要求。4.9冻融三次稳定性结果冻融稳定性结果见表A16和表A17，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、高浓度质控样品冻融三次后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为2.71%、4.43%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、高浓度质控样品冻融三次后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为15.62%、1.61%；结果表明Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013冻融三次后稳定性符合要求。4.10低温冻存1个月、2个月稳定性结果低温冻存1个月稳定性结果见表A22和表A23，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、高浓度质控样品低温冻存1个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.63%、-0.66%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、高浓度质控样品低温冻存1个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为10.51%、-10.12%。低温冻存2个月稳定性结果见表A24和表A25，UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013低、高浓度质控样品低温冻存2个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-2.14%、10.03%；UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013低、高浓度质控样品低温冻存2个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-8.32%、13.96%。4.11稀释10倍和20倍稳定性结果稀释10倍和20倍稳定性结果分别见表A18、9-2和表A20、10-2，原浓度为25000ng/ml的S-LEW-013和R-LEW-013血浆工作液采用空白血浆稀释10倍后前处理，进样标示浓度为2500ng/ml，检测浓度变异系数（CV%）分别为1.89%、1.72%，与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-5.30%、-8.81；原浓度为50000ng/ml的S-LEW-013和R-LEW-013血浆工作液采用空白血浆稀释20倍后前处理，进样标示浓度为2500ng/ml，检测浓度变异系数（CV%）分别为2.64%、2.82%，与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-5.45%、-8.46；结果表明Beagle犬血浆中S-LEW-013和R-LEW-013稀释10倍和20倍稳定性符合要求。5讨论5.1流动相的选择本次实验若只用超临界的CO2为流动相，最大的缺点是不能洗脱极性化合物，因此常常需要加入改性剂，如甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈等。经文献报导[17]，甲醇的适用效果是最好的，这是由于甲醇与CO2形成的二元混合物的临界温度和临界压力不太高,并且甲醇的极性在低碳醇中比较大[18]。5.2方法学验证数据分析该方法选择性良好，方法标准曲线的范围为10~5000ng/mL，LLOQ为10ng/mL，无残留现象。对于精密度和准确度，左旋泮托拉唑低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为2.70%、2.52%、3.02%；批间准确度RE%值分别为0.20%、-2.84%、-2.61%；右旋泮托拉唑低、中、高浓度QC样品批间精密度CV%值分别为4.92%、2.81%、2.72%；批间准确度RE%值分别为-1.99%、-3.58%、-2.40%；均符合接受标准。对于基质效应，低、高浓度下的目标化合物左旋泮托拉唑的峰面积比值平均值分别为81.75%、87.65%，内标非那西汀的峰面积比值平均值分别为72.24%、74.66%，内标归一化的基质因子平均值分别为1.16和1.20，总体变异系数分别为14.93%和13.96%，符合接受标准；低、高浓度下的目标化合物右旋泮托拉唑的峰面积比值平均值分别为80.90%、89.15%，内标归一化的基质因子平均值分别为1.15和1.22，总体变异系数分别为14.66%和13.44%，符合要求。对于提取回收率，低、高浓度下目标化合物左旋泮托拉唑的平均回收率分别为93.61%、102.50%；右旋泮托拉唑的平均回收率分别为102.16%、101.94%；内标非那西汀的平均回收率分别为96.48%、101.75%。对于室温放置6h稳定性，左旋泮托拉唑浓度低、高浓度质控样品在室温放置6h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.31%、0.90%；右旋泮托拉唑浓度低、高浓度质控样品在室温放置6h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.24%、2.55%，均符合接受标准。对于进样器温度下放置24h稳定性，左旋泮托拉唑低、高浓度质控样品在进样器温度下放置24h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-4.58%、6.07%；右旋泮托拉唑低、高浓度质控样品在进样器温度下放置24h后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为7.45%、4.48%；均符合接受标准。对于冻融三次稳定性，左旋泮托拉唑低、高浓度质控样品冻融三次后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为2.71%、4.43%；右旋泮托拉唑低、高浓度质控样品冻融三次后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为15.62%、1.61%；均符合接受标准。对于稀释10倍和20倍稳定性，左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑血浆工作液采用空白血浆稀释10倍后前处理，与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-5.30%、-8.81；采用空白血浆稀释20倍后前处理，与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-5.45%、-8.46；均符合接受标准。对于低温冻存长期稳定性，左旋泮托拉唑低、高浓度质控样品低温冻存1个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为1.63%、-0.66%；低温冻存2个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-2.14%、10.03%；右旋泮托拉唑低、高浓度质控样品低温冻存1个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为10.51%、-10.12%，低温冻存2个月后的检测浓度与标示浓度的相对误差（RE%）分别为-8.32%、13.96%，均符合接受标准。5.3本次实验的意义目前国内尚未有关于建立UPCC/MS-MS定量测定手性药物在生物血浆的浓度的方法的报道，但随着人们对生物样品分析研究的深入，传统的HPLC技术将无法满足人们对药物高效检测分析的要求，而UPCC/MS-MS在物质的检测分析中，表现出灵敏度高、分离度高、峰形好、出峰时间短和成本低等优势，在未来将会成为一个重要的检测方法，具有良好的发展前景。。结论综上所述，本次试验确定了方法的标准曲线范围，并对方法的选择性、标准曲线和定量下限（LLOQ）、残留、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、室温放置6h稳定性、进样器温度下放置24h稳定性、冻融三次稳定性、稀释10倍和20倍稳定性以及低温冻存1个月、2个月长期稳定性进行了考察。结果显示，该方法选择性良好，方法标准曲线的范围为10~5000ng/ml，LLOQ为10ng/ml；方法的精密度、准确度、基质效应、提取回收率、室温放置6h稳定性、进样器温度下放置12h稳定性、冻融三次稳定性、稀释10倍和20倍稳定性以及低温冻存1个月、2个月稳定性均符合接受标准。本研究建立的UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中L-LEW-013和R-LEW-013浓度的检测方法符合要求，可用于相关专题生物样品检测。参考文献：CaoH，WangMW，JiaJH，etal．Comparisonoftheeffectsofpantoprazoleenantiomersongastricmucosallesionsandgastricepithelialcellinrats［J］．JHealSci，2004,50(1):1MiuraM．Enatioselectivedispositionoflansoprazoleandrabeprazoleinhumanplasma［J］．YakugakuZasshi，2006，126(6):395.XieZY，ZhangYN，XuHY，etal．Pharmacokineticdifferencesbetweenpantoprazoleenantiomersinrats［J］．PharmＲes，2005,22(10):1678.NorikoM，HidekiY，MakotoT．Stereoselectivechiralinversionofpantoprazoleenantiomersafterseparatedosestorats［J］．Chirality，1998,10(8):747.矫喜梅,宫兆燕,董林等.注射用左旋泮托拉唑钠对大鼠单纯反流性食管炎的影响[J].医学综述,2018,24(16):3312-3315.刘淑平,王东凯,王坤等.RP-HPLC法测定左旋泮托拉唑钠肠溶片的含量及有关物质[J].药物分析杂志,2007(02):180-182.程艳玲,张昊然,张莉莉等.泮托拉唑钠对映体在犬体内的药代动力学研究[J].药物分析杂志,2014,34(12):2145-2149.邵卿,朱利平,乔红群等.伴随毒代在手性药物犬重复给药毒性研究中的作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2013,27(03):511-512.岳鹏,沈姣,乔红群等.注射用左旋泮托拉唑钠对大鼠胚胎-胎仔发育的毒性及伴随毒代动力学研究[J].华西药学杂志,2017,32(06):599-602.徐玲玲,王芳,贾庆文等.液相色谱-串联质谱法测定犬血浆中左旋泮托拉唑钠的浓度及其毒代动力学研究[J].中国药学杂志,2017,52(15):1359-1362.徐玲玲,王芳,刘爱明等.液相色谱-串联质谱法测定大鼠血浆中左旋泮托拉唑钠的浓度及其毒代动力学研究[J].药学研究,2017,36(05):259-261+286.李升妮.泮托拉唑手性药代动力学及其联合用药的药物相互作用研究[D].第二军医大学,2017.赵叶香,方云茜,孙鲁宁等.注射用左旋泮托拉唑钠和泮托拉唑钠在氯化钠注射液中的稳定性研究[J].药学与临床研究,2016,24(06):461-463+471.王欣,谭明芬,黄莉莉.泮托拉唑钠在大鼠体内药动学研究[J].现代药物与临床,2016,31(08):1141-1145.朱玲.注射用左旋泮托拉唑钠杂质D/F方法学研究[J].新丝路(下旬),2016(07):133+135.国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社.2015年版,四部,363-368.夏爽等.超临界流体色谱在手性药物拆分中的应用进展[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(12):217-220.武洁等.超临界流体色谱法分离手性药物[J].药学进展,2004(07):300-304.致谢时光匆匆如流水，毕业论文的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一向都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮忙，在那里请理解我诚挚的谢意！感谢唐旗羚老师对论文的修改提出了宝贵意见，使我的论文更加完善感谢。实习单位林俊粒老师悉心的指导，还有各位同事与同学给予我工作与学习上的帮助，他们用最真挚的情感和最实际的援助，帮我渡过了一处处的难关。附录A表A1UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度各批次标准曲线批次线性方程权重R²值接受/拒绝2018.07.02-Validation-01y=5.64301x+34.06891/x²0.980701拒绝2018.07.03-Validation-02y=4.67545x+0.2657011/x²0.999018接受2018.07.04-Validation-03y=8.31826x-24.30471/x²0.995958拒绝2018.07.19-Validation-04y=11.5814x+249.6181/x²0.147724拒绝2018.07.25-Validation-05y=8.91742x-11.95261/x²0.998249接受2018.07.26-Validation-06y=8.14402x-14.23071/x²0.997257接受2018.07.27-Validation-07y=7.67867x-25.6311/x²0.997689拒绝2018.07.30-Validation-08y=9.34536x-18.27241/x²0.998455接受2018.08.01-Validation-09y=2.50105x-3.828961/x²0.996474接受2018.09.01-Validation-10y=18.7478x-24.85241/x²0.998333接受表A2UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度各批次标准曲线批次线性方程权重R²值接受/拒绝2018.07.02-Validation-01y=5.06719x+38.44941/x²0.982595拒绝2018.07.03-Validation-02y=4.01975x+0.7961171/x²0.999127接受2018.07.04-Validation-03y=7.85221x-29.8691/x²0.997339拒绝2018.07.19-Validation-04y=10.7092x+241.9311/x²0.140475拒绝2018.07.25-Validation-05y=7.74029x-12.87341/x²0.997389接受2018.07.26-Validation-06y=7.23205x-9.940361/x²0.997457接受2018.07.27-Validation-07y=6.81628x-1.264771/x²0.995966拒绝2018.07.30-Validation-08y=8.53592x-18.88571/x²0.998164接受2018.08.01-Validation-09y=2.18816x-8.653961/x²0.998201接受2018.09.01-Validation-10y=17.5836x-6.688211/x²0.998500接受表A3UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度的精密度和准确度验证结果表QC样品低浓度QC中浓度QC高浓度QC第1批第2批第3批第1批第2批第3批第1批第2批第3批标示浓度（ng/ml）202020200200200400040004000检测浓度（ng/ml）20.33719.73020.070193.842198.727187.2743862.6553950.7793995.22118.85120.55119.433197.342201.773194.9333827.0703748.0844029.48119.98519.70519.653194.233194.530195.2463817.1923831.5684087.38920.29720.77219.273198.996199.241189.9433798.3493776.0814051.43620.28220.45319.698197.907195.574191.0753958.2673723.8424035.60820.87320.45020.309180.924192.707193.3853888.4493750.4843985.327批内平均值20.10420.27719.739193.874197.092191.9763858.6643796.8064030.744批内CV%3.372.211.973.441.721.621.522.210.93批内RE%0.521.38-1.30-3.06-1.45-4.01-3.53-5.080.77批间平均值20.040194.3143895.405批间CV%2.702.523.02批间RE%0.20-2.84-2.61表A4UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度的精密度和准确度验证结果表QC样品低浓度QC中浓度QC高浓度QC第1批第2批第3批第1批第2批第3批第1批第2批第3批标示浓度（ng/ml）202020200200200400040004000检测浓度（ng/ml）20.41316.52520.413195.129200.688184.6713895.8003936.0653955.42719.05319.84018.990194.695201.271189.9623880.3823799.2443949.22519.60720.22020.508191.352192.078189.4083807.5423863.9544055.29519.05420.17319.880195.330198.426182.9273871.5743771.4994087.81619.82120.25519.609197.768195.401187.6394006.8923764.5514088.67018.42419.71620.322184.708194.488195.1573874.8903753.6873912.082批内平均值19.39519.45519.954193.164197.059188.2943889.5133814.8334008.086批内CV%3.607.462.932.391.862.301.671.871.95批内RE%-3.02-2.73-0.23-3.42-1.47-5.85-2.76-4.630.20批间平均值19.601192.8393904.144批间CV%4.922.812.72批间RE%-1.99-3.58-2.40UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度标示浓度（ng/ml）检测浓度（ng/ml）第1批第2批第3批109.23410.03811.2681011.27210.13010.8051010.89410.36910.9851010.64310.26110.2801010.94110.70411.111109.68310.10711.275平均值10.44510.26810.954CV%7.682.383.42RE%4.452.689.54批间平均值10.556批间CV%5.51批间RE%5.56UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度标示浓度（ng/ml）检测浓度（ng/ml）第1批第2批第3批109.5049.73110.3831010.82711.0158.830109.55010.99910.2891010.45210.5379.9191010.07310.1318.9991010.0849.3189.650平均值10.08210.2899.678CV%5.086.696.71RE%0.822.89-3.22批间平均值10.016批间CV%6.38批间RE%0.16表A7UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度基质效应验证结果表QC样品低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）S-LEW-013面积比%内标面积比%内标归一化基质因子S-LEW-013面积比%内标面积比%内标归一化基质因子面积比%88.85104.890.8589.0398.790.9089.5572.271.2497.9479.711.2380.4067.421.1982.2870.151.1770.2663.951.1083.3258.951.4178.1163.051.2483.2366.171.2683.3461.881.3590.0874.221.21平均值81.7572.241.1687.6574.661.20CV%8.8422.7414.936.8618.4413.96表A8UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度基质效应验证结果表QC样品低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）R-LEW-013面积比%内标面积比%内标归一化基质因子R-LEW-013面积比%内标面积比%内标归一化基质因子面积比%84.84104.890.8193.0098.790.9491.0972.271.2696.4279.711.2181.8167.421.2185.7670.151.2278.0763.951.2285.3758.951.4575.3163.051.1984.9266.171.2874.2961.881.2089.4174.221.20平均值80.9072.241.1589.1574.661.22CV%7.8822.7414.665.3018.4413.44表A9UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度提取回收率验证结果表QC样品低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）提取后S-LEW-013峰面积未提取S-LEW-013峰面积提取后S-LEW-013峰面积未提取S-LEW-013峰面积峰面积相应值4234.3634376.545894795.688902835.8754185.5634682.322902978.500888111.5004221.5264420.270901789.938892172.0004165.8434385.079912631.188885804.6884170.9884842.827916601.375873550.5004345.8504347.102933140.688886450.000峰面积平均值4220.6894509.024910322.896888154.094CV%1.594.531.501.07平均回收率（%）93.61102.50表A10UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度提取回收率验证结果表QC样品低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）提取后R-LEW-013峰面积未提取R-LEW-013峰面积提取后R-LEW-013峰面积未提取R-LEW-013峰面积峰面积相应值3907.0503890.688786753.188805194.7503702.0583755.099785959.938778379.0004005.7913803.794794590.500783733.5633906.0943819.652817790.313779803.2503762.4403744.801824743.000791853.3133939.5363718.488813489.563792504.313峰面积平均值3870.4953788.754803887.750788578.032CV%2.961.652.101.28平均回收率（%）102.16101.94表A11UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中内标非那西汀浓度提取回收率验证结果表QC样品低浓度（1000ng/ml）高浓度（1000g/ml）提取后内标峰面积未提取内标峰面积提取后内标峰面积未提取内标峰面积峰面积相应值28376.01830764.83027512.78127602.66829059.54530572.60427528.21726969.36528949.56131266.75827102.32827589.47929186.46929411.19527671.65426972.31328531.50629425.14127901.08027320.03128749.11127713.22528763.05727159.047峰面积平均值28808.70229858.95927746.52027268.817CV%1.094.322.031.05平均回收率（%）96.48101.75表A12UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度进样器温度下放置24h稳定性验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）进样器温度下放置24h进样器温度下放置24h检测浓度（ng/ml）19.1934042.93217.9264242.60018.9024231.03119.8904314.54719.1394316.58519.4534308.428平均值19.0844242.687CV%3.462.47RE%-4.586.07表A13UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度进样器温度下放置24h稳定性验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）进样器温度下放置24h进样器温度下放置24h检测浓度（ng/ml）22.3753964.15022.1284194.44921.7964216.50420.7344244.38720.7094208.67521.1964248.056平均值21.4904179.370CV%3.322.57RE%7.454.48表A14UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度室温放置6h稳定性验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）室温下放置6h室温下放置6h检测浓度（ng/ml）15.4134130.12320.8764048.34122.5063980.92120.2864062.00420.3853998.74122.1003995.476平均值20.2614035.934CV%12.551.39RE%1.310.90表A15UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度室温放置6h稳定性验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）室温下放置6h室温下放置6h检测浓度（ng/ml）15.9614167.14020.2274089.25922.6844092.91220.4414210.89821.0594009.60721.1124042.400平均值20.2474102.036CV%11.211.84RE%1.242.55表A16UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中S-LEW-013浓度冻融三次稳定性考察验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）检测浓度（ng/ml）20.4534340.65420.2174284.05121.7514237.06320.1384132.45720.2474077.15720.4513992.956平均值20.5434177.390CV%2.953.17RE%2.714.43表A17UPCC-MS/MS测定Beagle犬血浆中R-LEW-013浓度冻融三次稳定性考察验证结果表低浓度（20ng/ml）高浓度（4000ng/ml）检测浓度（ng/ml）24.2