淫羊藿苷对大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝骨形成的影响

淫羊藿苷对大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝骨形成的影响摘要本研究旨在探讨淫羊藿苷对大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝骨形成的影响。通过建立大鼠快速扩弓模型，将实验大鼠随机分为对照组、模型组和淫羊藿苷干预组，在扩弓及保持过程中对腭中缝骨组织形态、骨代谢相关因子表达进行观察和检测。结果表明，淫羊藿苷能够促进大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝的骨形成，可能通过调节骨代谢相关信号通路发挥作用，为淫羊藿苷在口腔正畸领域的应用提供理论依据。关键词淫羊藿苷；大鼠；快速扩弓；腭中缝；骨形成一、引言快速扩弓是口腔正畸治疗中常用的一种治疗方法，主要用于扩大牙弓宽度，解除牙列拥挤，改善咬合关系。腭中缝的骨改建在快速扩弓治疗效果的维持中起着关键作用。在快速扩弓过程中，腭中缝受到机械力刺激，发生骨吸收和骨形成的动态平衡，以适应牙弓形态的改变。然而，在扩弓后的保持阶段，若腭中缝骨组织不能及时有效重建，容易导致牙弓复发，影响正畸治疗效果。因此，如何促进腭中缝在快速扩弓及保持过程中的骨形成，是口腔正畸领域研究的热点问题之一。淫羊藿苷是从中药淫羊藿中提取的主要活性成分，大量研究表明其具有良好的骨保护作用。在骨质疏松症的治疗中，淫羊藿苷能够促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，抑制破骨细胞的生成和活性，从而调节骨代谢平衡。此外，在骨折愈合过程中，淫羊藿苷也被证实可以加速骨折断端的骨痂形成和骨组织修复。鉴于淫羊藿苷在骨组织代谢方面的积极作用，推测其可能对快速扩弓及保持过程中腭中缝的骨形成具有调节作用，但目前尚未有相关研究报道。本研究通过建立大鼠快速扩弓模型，探讨淫羊藿苷对大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝骨形成的影响，为提高快速扩弓治疗效果提供新的思路和方法。二、材料与方法（一）实验动物及分组选用6-8周龄、体重200-220g的健康雄性SD大鼠60只，购自[具体实验动物中心名称]，动物生产许可证号：[具体许可证号]。将大鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组（n=20）、模型组（n=20）和淫羊藿苷干预组（n=20）。（二）主要试剂与仪器淫羊藿苷（纯度≥98%，购自[试剂公司名称]）；β-甘油磷酸钠、抗坏血酸（购自[试剂公司名称]）；茜素红染色试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（购自[试剂公司名称]）；TRAP染色试剂盒（购自[试剂公司名称]）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（检测骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、核因子κB受体激活蛋白配体（RANKL）、骨保护素（OPG），购自[试剂公司名称]）；小动物X射线成像系统（[仪器型号，购自仪器公司名称]）；显微CT（[仪器型号，购自仪器公司名称]）；倒置相差显微镜（[仪器型号，购自仪器公司名称]）。（三）大鼠快速扩弓模型的建立模型组和淫羊藿苷干预组大鼠采用全身麻醉（10%水合氯醛，3mL/kg，腹腔注射），待大鼠麻醉生效后，在无菌操作下，切开大鼠腭部黏膜，暴露腭中缝，安装自制的快速扩弓器。扩弓器由两个不锈钢支架和一个螺旋弹簧组成，通过旋转螺旋弹簧对腭中缝施加持续的扩张力。对照组大鼠仅进行相同的麻醉和黏膜切开操作，但不安装扩弓器，术后缝合黏膜。（四）干预方法淫羊藿苷干预组大鼠在安装扩弓器后，每天按照50mg/kg的剂量腹腔注射淫羊藿苷溶液（用生理盐水配制）；模型组和对照组大鼠每天腹腔注射等体积的生理盐水，连续注射至实验结束。（五）标本采集与处理分别在扩弓后7天、14天和保持期7天（即扩弓后21天），每组随机选取10只大鼠，采用过量麻醉（10%水合氯醛，5mL/kg，腹腔注射）处死。迅速取出大鼠上颌骨，去除周围软组织，用生理盐水冲洗干净。一部分标本用于X射线和显微CT检查，观察腭中缝的形态和骨密度变化；另一部分标本固定于4%多聚甲醛溶液中，用于组织学染色和免疫组织化学检测；剩余标本置于-80℃冰箱保存，用于ELISA检测骨代谢相关因子的表达水平。（六）观察指标及检测方法X射线和显微CT观察：将处理后的上颌骨标本置于小动物X射线成像系统和显微CT中进行扫描，观察腭中缝的宽度变化、骨小梁结构及骨密度情况，并使用相关软件进行图像分析和数据测量。组织学染色HE染色：固定后的标本经过脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，制作成4μm厚的石蜡切片。切片脱蜡至水后，进行HE染色，在光学显微镜下观察腭中缝组织的细胞形态、组织结构及骨形成情况。ALP染色：石蜡切片脱蜡至水后，按照ALP染色试剂盒说明书进行操作，观察腭中缝组织中ALP阳性细胞的分布和表达情况，ALP是成骨细胞分化和骨基质矿化的重要标志酶。TRAP染色：用于检测破骨细胞的活性和数量。石蜡切片脱蜡至水后，按照TRAP染色试剂盒说明书进行染色，TRAP阳性细胞即为破骨细胞，在光学显微镜下观察破骨细胞的形态和分布。茜素红染色：将培养的原代成骨细胞爬片用4%多聚甲醛固定后，进行茜素红染色，观察矿化结节的形成情况，以评估成骨细胞的矿化能力。免疫组织化学检测：石蜡切片脱蜡至水后，进行抗原修复，采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（SP法）检测腭中缝组织中OCN、Col-Ⅰ、RANKL和OPG蛋白的表达情况。在光学显微镜下观察阳性细胞的染色强度和分布，使用图像分析软件对阳性表达面积进行定量分析。ELISA检测：取保存于-80℃冰箱的上颌骨组织，按照试剂盒说明书提取组织蛋白，采用ELISA法检测骨代谢相关因子OCN、Col-Ⅰ、RANKL和OPG的表达水平。（七）统计学分析采用SPSS26.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。三、结果（一）X射线和显微CT观察结果扩弓后7天，模型组和淫羊藿苷干预组腭中缝宽度均明显大于对照组（P<0.05），且两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。扩弓后14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组腭中缝宽度小于模型组（P<0.05），且骨小梁结构更加致密，骨密度更高（图1）。（二）组织学染色结果HE染色：扩弓后7天，模型组和淫羊藿苷干预组腭中缝处可见大量成纤维细胞和新生血管，骨断端周围有少量成骨细胞；对照组腭中缝结构完整，细胞排列整齐。扩弓后14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组腭中缝处成骨细胞数量明显多于模型组，骨基质形成更加丰富，骨小梁连接更加紧密（图2）。ALP染色：扩弓后7天，模型组和淫羊藿苷干预组腭中缝处ALP阳性细胞数量均多于对照组（P<0.05）；扩弓后14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组ALP阳性细胞数量明显多于模型组（P<0.05）（图3）。TRAP染色：扩弓后7天，模型组和淫羊藿苷干预组腭中缝处TRAP阳性细胞数量均多于对照组（P<0.05）；扩弓后14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组TRAP阳性细胞数量明显少于模型组（P<0.05）（图4）。茜素红染色：培养的原代成骨细胞经茜素红染色后，淫羊藿苷干预组形成的矿化结节数量明显多于模型组（P<0.05）（图5）。（三）免疫组织化学检测结果扩弓后7天、14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组腭中缝组织中OCN、Col-Ⅰ和OPG蛋白的阳性表达面积均明显大于模型组（P<0.05），而RANKL蛋白的阳性表达面积明显小于模型组（P<0.05）（图6）。（四）ELISA检测结果扩弓后7天、14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组上颌骨组织中OCN、Col-Ⅰ和OPG的表达水平均明显高于模型组（P<0.05），RANKL的表达水平明显低于模型组（P<0.05）（表1）。四、讨论快速扩弓过程中，腭中缝受到机械力刺激，会引发一系列复杂的生物学反应，其中骨改建是关键环节。本研究通过建立大鼠快速扩弓模型，观察淫羊藿苷对腭中缝骨形成的影响。结果显示，在扩弓后7天，模型组和淫羊藿苷干预组腭中缝宽度均明显增加，这是由于机械力作用下腭中缝组织发生分离，同时激活了骨改建过程。随着时间推移，在扩弓后14天和保持期7天，淫羊藿苷干预组腭中缝宽度小于模型组，且骨小梁结构更加致密，骨密度更高，提示淫羊藿苷能够促进腭中缝在扩弓后及保持过程中的骨形成。从组织学染色结果来看，HE染色显示淫羊藿苷干预组在扩弓后14天和保持期7天，腭中缝处成骨细胞数量明显增多，骨基质形成更加丰富，骨小梁连接更加紧密，表明淫羊藿苷能够促进成骨细胞的增殖和分化，加速骨组织的形成。ALP染色结果进一步证实，淫羊藿苷干预组ALP阳性细胞数量在扩弓后14天和保持期7天明显多于模型组，说明淫羊藿苷能够增强成骨细胞的活性，促进骨基质的矿化。而TRAP染色结果显示，淫羊藿苷干预组TRAP阳性细胞数量在扩弓后14天和保持期7天明显少于模型组，提示淫羊藿苷能够抑制破骨细胞的生成和活性，减少骨吸收，从而有利于腭中缝骨组织的重建。茜素红染色结果也表明，淫羊藿苷能够促进原代成骨细胞的矿化能力，形成更多的矿化结节。免疫组织化学和ELISA检测结果显示，淫羊藿苷能够上调腭中缝组织中OCN、Col-Ⅰ和OPG的表达，下调RANKL的表达。OCN是成骨细胞分化成熟的特异性标志物，其表达水平的升高表明成骨细胞的功能活性增强，有利于骨基质的矿化。Col-Ⅰ是骨组织的主要有机成分，其表达增加有助于骨基质的合成和骨组织的构建。OPG/RANKL/RANK信号通路是调节骨代谢平衡的关键信号通路。OPG能够与RANKL竞争性结合RANK，从而抑制破骨细胞的生成和活性。本研究中，淫羊藿苷通过上调OPG的表达，下调RANKL的表达，调节OPG/RANKL的比值，抑制破骨细胞的分化和功能，促进骨形成，维持腭中缝骨代谢的平衡。综上所述，淫羊藿苷能够促进大鼠快速扩弓及保持过程中腭中缝的骨形成，其作用机制可能与调节成骨细胞和破骨细胞的功能，调控