CN105452440B 细胞的培养方法、细胞培养装置及试剂盒 （Ｕｂｅ株式会社）

2016.01.26PCT/JP2014/0704072014.07.25WO2015/012415JA2015.01.29hESC-derivedretinalpigmentepionbiopolymercoatedpolyimidemembranes.本发明的细胞的培养方法包括将细胞适用于聚向上述润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液，进而使细胞悬浮液中的细胞蓄积到上述膜2所述聚酰亚胺多孔质膜是具有下列层的三层结构的聚酰亚胺被所述隔壁以及所述表面层A和B包围的多个大空隙，其中所述多放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多孔质膜而促将上述聚酰亚胺多孔质膜之一面或两面用细胞培养基或灭菌7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其包括12.权利要求1所述的方法，其包括将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右积层到321.权利要求20所述的细胞培养装置，其中22.用于在权利要求1～19之任一项所述的4[0001]本申请主张基于2013年7月26日中提出的日本国申请特愿2013-[0005]SCIVAXCorporation开发的NanoCulture(注册商标)Plate(NCP)是由纳米印迹技[0007]特开2009-213421记载使用蜂巢状多孔质膜(蜂巢膜)的球形的制造方法及球形制状而增殖，由细胞培养形成的是同样的形状的细胞多数凝集而成三维状态的球形方面共5[0019]非专利文献1:Takahashietal.，TissueEngineeringPartA.June2012，[0027]实施方式1所述的方法，其包括将细胞接种于上述聚酰亚胺多孔质膜的表面的工[0031]放置上述聚酰亚胺多孔质膜，或者移动上述聚酰亚胺多[0043]实施方式1～6之任一项所述的方法，其包括向细胞培养容器中放入细胞培养基、[0045]实施方式7所述的方法，其特征在于使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔质膜的小6[0062]实施方式1～13之任一项所述的方法，其中细胞在聚酰亚胺多孔质膜的表面及内[0074]实施方式1～19之任一项所述的方法，其中聚酰亚胺多孔质膜是含自四羧酸二酐7[0076]用于在实施方式1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的细胞培养装置，[0078]实施方式21所述的细胞培养装置，其中2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右[0080]用于实施方式1～20之任一项所述的细胞的培养方法中使用的试剂盒，其含聚酰[0093]【图11】图11显示将人皮肤成纤维细胞使用膜厚25μm的聚酰亚胺多孔质膜培养时[0094]【图12】图12显示将人皮肤角化细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明的方[0095]【图13】图13显示将人脐带静脉内皮细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的本申请发明[0096]【图14-1】图14-1显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μm片)的本申请发[0097]【图14-2】图14-2显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μm片)的本申请发[0098]【图14-3】图14-3显示将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μm片)的本申请发8[0099]【图15-1】图15-1显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(25μm片)的本申请发[0100]【图15-2】图15-2显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(40μm片)的本申请发[0101]【图15-3】图15-3显示将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜(75μm片)的本申请发而到聚酰亚胺多孔质膜的表面的细胞可在膜的表面及/或内部稳定生长－增殖。细胞根据生9体用细胞培养液或灭菌的液体润湿后，也可向润湿的聚酰亚胺多孔质膜装填细胞悬浮液。[0123]例如，本说明书的实施例4中记载的一点湿法是以膜的飞散防止作为主目的而使流出。在本发明的实施例3中，适用于本发明的上述聚酰亚胺多孔质膜的前的细胞培养基(细胞悬浮液)中活细胞率是90但适用于聚酰亚胺多孔质膜，流出的液体中活细胞率是8.002.70.200.247.47.4[0130]本发明还含通过使处于悬浮状态的粘接性细胞与聚酰亚胺多孔质膜悬浮共存而[0131]细胞培养由细胞培养中的存在形态而培养细胞可分类为粘接培养系细胞和悬浮胺多孔质膜悬浮于细胞培养基中的状态下使用时，也可使用2个以上的上述聚酰亚胺多孔膜的细胞培养中，先前含持的聚酰亚胺多孔质膜的大表面积的全部成为可细胞培养的面[0135]作为与小片集合体同样的想法，也可将2个以上的聚酰亚胺多孔质膜上下或左右显示细胞在立体结构体之内部生长增殖的报告例。由在本发明中聚酰亚胺多孔质膜的利属于脊椎动物门的动物来源的细胞和无脊椎动物(属于脊椎动物门的动物以外的动物)来[0144]本说明书中的古细菌及细菌的种类也不特别限定。古细菌由甲烷菌－高度好盐[0145]可在本发明的方法中利用的动物细胞或植物细胞的种类的细胞种的能力(分化多能性)的干细胞。有例如骨髓中的造血干细胞成为血细胞的原来，细胞(中国仓鼠卵巢来源)、HEK293细胞(人胎儿肾脏来源)、HL-6HeLa细胞(人子宫颈癌来源)等人的各种各样的生物种的各种各样的组织来源的细胞株。二酐和二胺得到的聚酰亚胺的性质带来影响的[0154]也含成形含自四羧酸成分和二胺成分得到的聚酰胺酸溶液和着色前体的聚酰胺300℃以上的热处理而热分解，优选为碳化生成着色化物，更优选为生成黑色系的着色化 [0175](i)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和芳香族二[0178](iii)由选自联苯基四羧酸单位及苯均四酸单位的至少一种四羧酸单位和选自苯层(A面及B面)和所述2个的表面层之间所夹的大空隙层的多层结构的聚酰亚胺多孔质膜。述隔壁以及上述表面层(A面及B面)包围的膜平面方向的平均孔径是10～500μm的多个大空[0181]在一实施方式中，聚酰亚胺多孔质膜的A面是有平均孔径15μm以下的小的孔的网[0183]接种到聚酰亚胺多孔质膜的表面的细胞可在膜的表面及/或内部稳定生长－增例如，包括BDFalcon公司制的细胞培养皿或ThermoScientific公司制的Nunc细胞工厂形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面或大孔结构的B面朝上而浸渍。另行准备培养基每活细胞率94％)的人间质系干细胞悬浮液。将各60μl细胞悬浮液添加到上述正方形容器中代表性的干细胞之一的人间质系干细胞也可由本申请发形的聚酰亚胺多孔质膜使网结构的A面或大孔结构的B面朝上而浸渍。另行准备培养基每说明)的吸入接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜)的人皮肤成纤维细胞悬浮液。在10cm×14cm的角酰亚胺多孔质膜B面添加各20μl细胞悬浮液。将渗出的液除尽，将聚酰亚胺多孔质膜移到24小时后固定－荧光染色(DAPI、或者肌动蛋白+DAPI)的样品的荧光显微镜照片及实体荧104个入接种进行细胞的向聚酰亚胺多孔质膜的适用[0210]在置膜的预定的中央部使10μl左右地并排各10个灭菌－干燥的1.4cm见方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜A面及B面，添加各聚酰亚胺多孔质膜各40μl细胞悬浮液。除尽渗出的液，将聚酰亚胺多孔质膜每接种面移到[0215]将一边10cm的正方形的聚酰亚胺多孔质膜使用夹细断为大概膜的小片的适用。方的正方形的聚酰亚胺多孔质膜15个上下左右地一部分重复地随机地并排。培养基每1ml悬浮9.0×105个的细胞(其中，活细胞是7.4×105个，使死细胞是1.7×105个、活细胞率用膜荧光染色剂CellMask(CellMask(商标)Orangeplasmamembranestain(Life表性的株化细胞之一的PC12细胞也可由本申请发明的[0226]由此方法求出培养条件和在CCK8浓度的条件的吸光度和实际的细胞数的相关系型培养皿，加一定量的加5％的CCK8的培养基，在温育器内保存1～3小时，移出上清，用[0232]向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(KGM-Gold角化细胞增殖培养基构的A面朝上而浸渍。将4×104个的人皮肤角化细胞添加到上述正方形容器中的细胞培养光显微镜(LeicaM165FC(Leica公司制))观察经时细胞[0237]向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(EGM-2BulletKit(LONZA公司))正方形的聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4×104个的人脐带[0238]用细胞培养装置培养，在3天、6天、10天后，固定－染色(CellMask+DAPI及[0241]在本实施例中，将Vero细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的[0242]向2cm×2cm的灭菌的正方形容器加细胞培养基(向DMEM添加10％FBS及抗生物质聚酰亚胺多孔质膜每1个自然接种4×104个的V[0246]在本实施例中，将HeLa细胞由使用聚酰亚胺多孔质膜的[0247]结果示于图15-1～图15-3。结果显示，即使对于作为代表性的株化细胞之一的