（正式版）T∕CSC 003-2026 柑橘黄龙病田间防治药效试验准则

ICS65.020CSCGuidelinesforfieldefficacyevaluationagainstCitrusHuT/CSC003—2026前言 II 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 5实验室设置 6药效评估方法 2附录A（资料性）树干注射相关信息 7附录B（资料性）黄龙病菌（亚洲种）16SrDNA基因片段序列 8T/CSC003—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国柑桔学会提出并归口。本文件起草单位：华中农业大学、广西特色作物研究院、赣州市柑桔科学研究所、广西大学、广西壮族自治区水果技术指导站、云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所、广西田园生化股份有限公司。本文件主要起草人：徐强、张旺、黄伟、徐远涛、陈传武、严翔、夏长秀、王绍华、韦杰、郑吉祥、彭程、汪龙湛、李良军、丁芳、赵帅、袁恩林、黄树清。1T/CSC003—2026柑橘黄龙病田间防治药效试验准则本文件规定了柑橘黄龙病亚洲韧皮部杆菌(CandidatusLiberibacterasiaticus)田间防治药效试验的术语与定义、方法原理、实验室设置、药效评估方法等技术要求。本文件适用于柑橘黄龙病田间防治药效试验方法及药效评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T28062柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程GB/T29393柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1末梢枝terminalshoot也称为顶梢枝，是指位于植株最外围、最顶端的当年生枝条。3.2有效检测枝effectivedetectionbranch经过实时荧光定量PCR检测黄龙病菌含量处于中等稳定水平（26≤CT值≤32）的末梢枝。3.3抑菌率bacterialinhibitionrate处理周期内植株黄龙病菌拷贝数的下降值占处理前植株拷贝数的百分比。4方法原理初始模板黄龙病菌含量的不同，实时荧光定量PCR反应管内的荧光物质达到设定的可检测阈值时所经历的CT值不同，因此CT值可以用于判定检测样品的初始菌量。通过将药剂处理前后的样品CT值换算为对应的拷贝数，并计算处理周期内拷贝数的下降值，计算出药剂的抑菌率，实现对处理药剂的药效评估。5实验室设置2T/CSC003—2026实验室的设置按照GB/T28062的规定执行。6药效评估方法6.1实验设计与材料6.1.1实验植株筛选与有效检测枝的确定6.1.1.1候选植株环视植株一周，按照GB/T29393的规定选择具有黄龙病典型症状的植株作为候选植株。6.1.1.2有效检测枝对候选植株，从东、南、西、北四个方位各选取2个末梢枝（以有症状的枝条优先）进行挂牌标记。每个取样枝选择2片已充分展开的成熟叶，每个叶片用打孔器（孔径6mm）对叶片主叶脉打取2个叶盘，每个取样枝共4个叶盘，混样检测黄龙病菌含量。选取26≤CT值≤32的枝条作为有效检测枝，并相应挂牌标记。6.1.1.3实验植株选定有效检测枝数≥3的植株作为实验植株。6.1.2药剂配比与处理6.1.2.1药剂配比药剂浓度为5mg/mL，体积250mL～500mL，根据树体大小适当调整（可按照品种正常单株产量每50kg对应250mL进行配比）。6.1.2.2对照设置以水（溶剂）作为对照，参照6.1.2.1的配比进行配比。6.1.2.3处理方式对实验植株进行树干注射处理：每棵树有两个注射口，位于树干对侧，距离地面约15cm处，用4mm钻头与树干呈45度角，钻入木质部组织25mm～30mm。6.1.2.4处理时间处理时间以萌芽前为最佳时间。6.1.2.5试验周期试验周期为30d。6.2处理后样品采集6.2.1采样方式实验处理后30d，参照6.1.1的方法采样，对同一有效检测枝的叶片进行采集，处理后采样叶片位置与处理前采样位置接近且处理后采样叶片与处理前采样叶片为同一梢期和同一叶龄为宜。3T/CSC003—20266.2.2样品贮运与保存实验采集样本的贮运与保存按照GB/T28062的规定执行。6.2.3样品DNA的提取与制备实验采集叶片样本DNA的制备，具体制备方法按照GB/T28062的规定执行。6.2.4样品DNA的浓度调整在超微量紫外分光光度计上测量制备的DNA的浓度，并调整浓度至100ng/μL备用。6.3样品含菌量的荧光定量PCR检测与数据采集参照下表配置10μL反应体系进行实时PCR扩增，标准扩增方案为预变性95℃/10min；然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1s；共45个循环，仪器设置在每个循环的退火延伸阶段自动采集荧光。所有反应一式三份进行，每次运行额外包含一个阴性对照（无菌水）和一个阳性对照（经检测CT值≤32）。用两对引物同时检测所有样品，一对为HLBLasf/HLBLasr，检测黄龙病菌拷贝数；另一对为COX-F/COX-R，用作均一化模板DNA浓度。采用荧光定量PCR仪配套的数据分析软件进行数据处理与分析。10μL荧光定量反应体系组成成分见表1。表110μL荧光定量反应体系组成成分516.4药效分析与评价6.4.1CT值与黄龙病菌（亚洲种）拷贝数转换的标准曲线建立在实际操作过程中，由于不同实验仪器测量响应值存在差异，为实现对黄龙病菌（亚洲种）含量的绝对定量检测，针对不同荧光定量检测仪器都需要绘制其相对应的CT值与黄龙病菌（亚洲种）拷贝数转换的标准曲线。16SrDNA是细菌中的一个高度保守的基因片段，通过对16SrDNA基因进行测序，可以确定微生物群落中存在的不同菌属和菌种，并评估它们的相对丰度。因此，选定柑橘黄龙病菌（亚洲种）的16SrDNA基因片段作为目标检测序列。柑橘中保守的植物细胞色素氧化酶（COX）基因序列，作为DNA质控内参。6.4.1.116SrDNA序列的获取及扩增基于已完成测序的柑橘黄龙病菌（亚洲种）基因组序列，获得其16SrDNA基因片段作为目标检测序列。通过PCR扩增该序列后，利用T/A克隆技术将其构建到克隆载体上，在大肠杆菌中大量扩增含有4T/CSC003—2026黄龙病菌（亚洲种）16SrDNA序列的重组质粒，并提取、纯化质粒DNA。使用超微量紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度。黄龙病菌（亚洲种）16SrDNA基因片段序列见附录B。基于16SrDNA基因序列设计的正反引物及探针如下：HLBLasf引物：AGTCGAGCGCGTATGCGAATHLBLasr引物：GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAGHLBLasp探针：5′-FAM-AGACGGGTGAGTAACGCG-BHQ-1-3′基于植物细胞色素氧化酶（COX）基因序列设计的正反引物及探针如下：COX-F引物：GTATGCCACGTCGCATTCCAGACOX-R引物：GCCAAAACTGCTAAGGGCATTCCOXp探针：5′-FAM-ATCCAGATGCTTACGCTGG-BHQ-1-3′6.4.1.2标准品的制备根据质粒DNA的分子量，计算出每纳克（ng）DNA中所含有的黄龙病菌（亚洲种）16SrDNA的拷贝数，计算公式如下：Y=ng×(6.022×1023)/[L×(1×109)×650]式中：Y——拷贝数；ng——含有的DNA分子质量，以纳克（ng）为单位；6.022×1023——为阿伏伽德罗常数；L——质粒DNA的长度（16SrDNA与载体的长度之和），以碱基对（bp）为单位；650——单个碱基对的平均分子量，以摩尔质量（g/mol）为单位。将6.4.1.1中所制备的高浓度质粒DNA溶液进行系列梯度稀释，依次制备拷贝数为107、106、105、104、103、102、101的标准品溶液。6.4.1.3标准品的荧光定量PCR检测与数据收集以制备的标准品溶液作为模板，每个稀释浓度3个重复，进行实时荧光定量检测，记录不同稀释浓度对应的CT值。6.4.1.4标准曲线的绘制以已知浓度的标准品的log10(拷贝数)为Y轴，相应的CT值为X轴，进行标准曲线的绘制。使用线性回归分析获得斜率（slope）、截距（intercept）和相关系数（R2）。相关系数（R2）应≥0.99，否则需重复6.4.1的步骤，重新进行标准曲线的绘制。绘制完成的标准曲线，log10(拷贝数)与CT值之间的线性关系格式如下：log10(Y)=a×X+b式中：T/CSC003—2026Y——拷贝数；X——样品检测CT值；a——线性回归分析获得的斜率（slope）；b——线性回归分析获得的截距（intercept）。6.4.2基于黄龙病菌拷贝数转换的平均抑菌率计算将实时荧光定量检测结果输出保存，使用DNA质控内参式中：Xcor——校准后有效检测枝CT值；Xsta——有效检测枝CT值；i——n——有效检测枝数量。使用校准后的样品CT值完成CT值与拷贝数的换算，换算公式如下：计算待评估药剂处理前后黄龙病含菌量（即：拷贝数）降低的比率，计算公式如下：式中：Z——单个有效检测枝抑菌率；Y0——处理前拷贝数；Y1——处理后拷贝数。将每个单株的单个有效检测枝含菌量降低率取平均值，得到单株抑菌率。计算公式如下：i：单株抑菌率；Zj——有效检测枝j的含菌量降低率；m——有效检测枝数量。式中：p——植株数量。ave药剂平均抑菌率；p——植株数量。6.4.3田间药效分级标准与结果判定6.4.3.1结果判定将6.4.2中计算得到药剂处理组平均抑菌率和对照组含菌量变化率汇总，进行校准计算，校准计算公式如下：ave,tg——处理组平均抑菌率；o：药剂真实抑菌率；ave,tg——处理组平均抑菌率；aveave,ck——对照组含菌量变化率。将校准计算后的药剂真实抑菌率参照田间药效分级规则表进行防治效果评估。6.4.3.2特殊情况若6.4.2中计算得到对照组的含菌量变化率为负值，说明水（溶剂）对黄龙病菌无防治效果，则：ave,tg将药剂真实抑菌率参照田间药效分级规则表进行防治效果评估。6.4.3.3田间药效分级标准田间药效分级规则表见表2。表2田间药效分级规则表注：若药效真实抑菌率小于或等于0，则说明药剂对T/CSC003—2026（资料性）树干注射相关信息A.1树干注射A.1.1树干钻孔每棵树两个注射孔，位于树干的对侧。在植株树干距地面约15cm处，使用4mm钻头斜向下与树干呈45度角钻孔，钻孔深度为25mm～30mm。A.1.2药剂注射A.1.2.1排气针头插入注射孔前，先开启流速控制开关，排出针管内残留空气，随后关闭流速控制开关。A.1.2.2药剂注射将针头准确插入注射孔并插紧固定，开启流速控制开关，实施药剂注射。A.1.2.3漏气检查药剂注射过程中观察注射孔有无漏液，若出现漏液，可使用工具紧固处理。A.1.2.4药剂放置注射前，将加压药剂容器倒置并保持出口始终浸没于液面下，使药剂在压力作用下连续注入，避免容器内空气进入注射管道，保障植株正常吸收药剂。T/CSC003—2026（资料性）黄龙病菌（亚洲种）16SrDNA基因片段序列AACGAACNCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCGTATGCAATACGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTAGGAATCTACCTTTTTCTACGGGATAACGCATGGAAACGTGTGCTAATACCGTATACGCCCTATTGGGGGAAAGATTTTATTGGAGAGAGATGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCGCCGGAGAAGATAATGACGGTATTCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCGAGCGTTGTTCGGAATAACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGCGATTAAGTTAGAGGTGAAATCCCAGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTAATACTGGTTGTCTAGAGCTTTAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCTGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTTGGGTGGTTTACCATTCAGTGGCNCACGTAACGCATTAAGCACTCCNCCTGGGGAGTACGGT