CN110128518B 利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法 （中国农业科学院作物科学研究所）

WO2018035354A1,2018.02.22NONE.NCBIReferenceSequence:NONE.NCBIReferenceSequence:NONE.NCBIReferenceSequence:NONE.NCBIReferenceSequence:利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法本发明提供一种利用基因编辑技术创制玉ZmGA20ox3/ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA，将含有编码所述sgRNA的DNA片段连接到对基因ZmGA20ox3/ZmGA20ox5的定点突变，进而明首次揭示了玉米ZmGA20ox3/ZmGA20ox5基因的生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmGA20ox3/ZmGA20ox5基因进行基因编辑，并进一步筛选获得不含转基因插入片段的突变体材2ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接基因ZmGA20ox5编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN3[0002]二十世纪玉米产量的提高主要依赖提高单位面积内玉米的种植密度(Duvicket是不具有活性的，植物体内GA正常的含量由结合态GA与游离态GA的动态平衡来维持[0004]CRISPR/Cas9技术可以精准的对基因组中的特定部位进行编辑，既可以实现基因[0006]为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供控制植物株高的基因，包括玉米[0011](b/)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功4[0012]第二方面，本发明提供玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因在玉米矮化材料育种的目标基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Cas的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5的定点突变，进而获得ZmGA20ox3和/或[0017]本发明中，所述携带Cas9的载体为pBUE411。所建玉米转化载体为pBUE411-2gR-GA20ox3和pBUE411-2gR-G胞分化等方面均有缺陷，表现出叶片狭窄并且株高极度矮化(Rosaetal.,2017)。玉米blh12/blh14双突变体节间长度严重缩短引起矮化的表型，且该突变体雄穗发育畸形导致完全不育(Tsudaetal.,2017)。玉米gif1突变体叶片变窄、节间不规则地弯曲且植株变[0023]本发明首次揭示了玉米ZmGA20ox3和/或ZmGA20ox5基因的生物学功能，通过5均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,目的基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5及相关信息从数据库MaizeGDB(https://的第一个外显子上，两个靶位点(位于不同表达盒)串联到同一个基因编辑载体上。[0030]实施例2基因编辑载体的构建[0031]根据所选的编辑位点以及载体pCBC-MT1T2和pBUE411多克隆位点处的酶切位点设重二亚二团二[0035]用两轮PCR方法扩增目的片段，第一轮PCR反应使用第一对引物MT1-F0/MT2-R0以6[0051]将实施例2构建的基因ZmGA20ox3、ZmGA20ox5编辑载体分别转入7[0060](9)挑取平板上长出的单菌落，接种于含相应抗性的YEB液体培养液中，28℃基中，于200rpm、28℃振荡过夜。次日，将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中，于8℃∞。产物大小约为1.1Kb，扩增产物条带大小正确的PCR产物送去测序。筛选到两个ZmGA20ox3基因编辑的突变体株系(图1，A)和4个ZmGA20ox5基因编辑的突变体株系(图1，9commercialhybridmaizebreedingprogram.PlantBreeding,2010,24:109-151.[0084][2]HeddenP.,PhillipsA.L..Gibberellinmetabolism:newinsightsrevealedbythegenes.TrendsinPlantScience,2000,5(12):523-530.[0085][3]KawaideH..Biochemicalandmolecularanalysesofgibberellinbiosynthesisinfungi.JournaloftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan,2006,70(3):583-590.QTL,qPH3.1,forplantheightinmaize.ThePlantJournal,2012,73(3):405-416.[0087][5]RosaM.,AbrahamJ.,MaríaJ.,etal.ThemaizeMID-COMPLEMENTINGACTIVITYhomologCELLNUMBERREGULATOR13/NARROWODDDWARFcoordinatesorgangrowthandtissuepatterning.ThePlantCell,2017,29(3):4[0088][6]TsudaK.,Abraham-JuarezM.J.,MaenoA.,etal.KNOTTED1cofactors,BLH12andBLH14,regulateinternodepatterningandveinanastomosisinmaize.ThePlantCell,2017,29(5):1105-1118.[0089][7]ZhangD.,SunW.,SinghR.,etal.GRF-interactingfactor1(gif1)regulatesshootarchitectureandmeristemdeterminacyinMaize.ThePlantCell,201830(2):360-374.15