第五章薄层色谱法

第五章薄层色谱法(4)在我国,1962年化学通报上发表了关于薄层层析的综合报道,并在中草药有效成分的分离和鉴定方面获得了广泛的应用.

现在科研单位不但把薄层层析法作为分离和分析的手段，许多工厂也把薄层层析广泛的用在反应终点控制、工艺条件的选择、产品质量的控制和未知试样的解剖。4/28/20262薄层层析有如下优点：

1.快速做一次薄层层析只需要10－20min,而做一次纸层析需要数小时。

2.分离效率高薄层层析可使性质相似的物质如同系物或异构体分离，其分离效率比纸层析高100－1000倍。

3.灵敏度高薄层层析可检出的物质比纸层析高100倍。4/28/202634.显色方便可以喷各种显色剂，甚至可以喷强腐蚀性的浓硫酸，可以高温灼烧，这些都是纸层析所不允许的。

5.应用面广可以进行定性鉴定，也可以进行定量测定。由于上述种种特点，薄层层析法得到日益广泛的应用和迅速的发展。4/28/20264适当的稳定性、粘度低和低毒性。机化合物喷以此种显色剂后会出现棕色到黑色斑点，这种焦化斑点常常会出现荧光①在紫外线灯下观察常用的紫外线灯是一种汞灯，它一般有两种滤光片，一种能透过254nm的紫外光，另一种能透过366nm的紫外光。利用薄层色谱扫描仪进行定量测定⒝酸碱指示剂例如喷以0.把展开的薄层放在紫外线灯下观察，含有共轭双键的有机物能吸收紫外光呈现暗斑。在薄层交界处形成浓缩带，然后进入第2种薄层进行展开。②如果两种混合溶剂分离效果还不够好，可以考虑加入第三种或第四种组分的混合溶剂.选择合适的吸附剂和展开剂是薄层层析②微型薄层可用小玻片铺成薄层，点上试液，用各种认为可能应用的展开剂进行展开试验，从而选择适当的展开剂，再应用于一般薄层，用微型薄层材料和时间都比较节省。吸附剂的颗粒直径大小对分离效果和层(2)层析时的温度除影响展开剂的挥发性外，还影响各个组分在固定相和流动相的分配系数，因而温度显著影响Rf值。由于工作需要，各种特制薄层相继出现，这里介绍数种：lgω~成线性关系常用的吸附剂：薄层层析法的分类和原理根据薄层层析所依据的分离原理可以把薄层层析分为吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析和分子排阻薄层层析等，其中最常用的是吸附薄层层析，现以最常见的吸附薄层层析为例介绍其原理：

4/28/20265

溶剂前沿

斑点A

斑点B

bal

点样线原点4/28/20266各斑点在薄层中的相对位置

AB为了应用方便,通常乘以100,用HRf表示

HRf=100Rf第二节薄层层析用的吸附剂和薄层

1.吸附剂选择合适的吸附剂和展开剂是薄层层析4/28/20267能否获得成功的关键．吸附剂和展开剂的选择要结合被分离样品的性质来进行。薄层层析中的吸附剂和柱层析相似，首先应该考虑应如何层析，一般的讲，非极性或弱极性的组分的分离用吸附层析，水溶性组分的分离用分配层析。常用的吸附剂：（1）氧化铝氧化铝铺层时一般不加粘合剂，直接用干4/28/20268粉铺层，得到的层析板称为“干板”或“软板”，但也可以加煅石膏作粘合剂，这种混有煅石膏的吸附剂称为氧化铝G，用氧化铝G加水，调成糊状，铺层活化后的层析板称为“硬板”。干法铺层的氧化铝是150－200目，相当于颗粒直径75－100μm,湿法铺层250－300目（相当于颗粒直径50－60μm）吸附剂的颗粒直径大小对分离效果和层4/28/20269析速度均有影响，颗粒太粗，层析展开速度较快，分离效果不好。颗粒太细，层析展开速度太慢，太细的吸附剂用干法铺层就有困难。（2）硅胶硅胶是一种酸性吸附剂,具有良好的分离能力。但机械性能较差,必须加入粘合剂后方能用于薄层层析，常用的粘合剂是煅石膏、聚乙烯醇、淀粉、羧甲基纤维素酸钠等，薄4/28/202610层层析用硅胶的粒度为250－300目。硅胶H不含粘合剂,使用时需要另外加入。硅胶G硅胶和石膏(13－15％)混合而成。硅胶GF254

硅胶中既含有粘合剂石膏又含有荧光指示剂，在254nm的紫外线照射下呈现出黄绿色荧光。硅胶HF254＋366

硅胶中不含有粘合剂石膏,只含有荧光指示剂,这种荧光指示剂在254nm和366nm的紫外线照射下均能出现荧光。4/28/202611常用的荧光指示剂锰激活的硅酸锌ZnSiO4•Mn,在254nm的紫外线灯照射下能够产生荧光;银激活的ZnS和CdS,ZnS•CdS•Ag在366nm的紫外线照射下能够产生荧光。硅胶即可以进行吸附层析，又可以进行分配层析，主要的区别是在于活化程度不同，前者活化程度高，后者活化程度低。（3）纤维素可在实验室制备，取脱脂棉或滤纸剪成小4/28/202612块加适量的5％的盐酸，加热煮沸3小时，冷却过滤用水洗至无氯离子，用5％乙醇洗3次，再用乙醚洗一次，挥发除去溶剂后，于105°C活化2小时，筛取100－200目备用。（4）聚酰胺聚酰胺是一种具有酰胺结构的高分子化合物，层析用的酰胺主要是锦纶（又称尼龙），酰胺基上的羰基或胺基可与酚类、4/28/202613或某些酸形成氢键而具有吸附作用，由于各化合物与锦纶形成氢键的能力不同，因此，聚酰胺对酚类、酮类、硝基苯衍生物及其某些酸具有选择性吸附作用，分离性能良好。

2薄层层析板的制备目前所用的各种薄板可大致分类如下：普通板：加粘合剂－硅胶、氧化铝不加粘合剂－氧化铝、聚酰胺、纤维素4/28/202614

加工板：荧光板－加入荧光性物质缓冲板－用不同pH值的缓冲溶液调糊酸碱板－用稀酸或稀碱溶液调糊实验室常用的是加粘合剂的普通板。不加粘合剂的称为软板（吸附剂在层析板上不牢固）。加粘合剂的板称为硬板（吸附剂在层析板上较牢固）。制取的方法就是将吸附剂均匀涂铺在玻璃板上成为薄层，制得的薄层应光滑、厚度均匀（干燥后的厚度－4/28/2026150.2mm)薄板常用玻璃制成,其规格60cm×20cm的长方形或20cm×20cm的正方形,微量薄板常用的微型载玻片.一般氧化铝多用于干法制成软板,纤维素常用湿法制成软板,而硅胶采用硬板.（1）软板的制备:

软板制备最简便的方法是用一根直径为的玻璃棒,根据薄层的厚度在玻璃棒上绕几圈胶布,胶布的厚度0.3-0.5mm,将干4/28/202616的吸附剂在玻璃板上摊开,玻璃板一端固定,防止玻璃板在推进时移动,如下图所示,用玻璃棒在玻板上将吸附剂沿一个方向推成薄层.4/28/202617

氧化铝和硅胶可用这样的干法制成软板，而纤维素板可用2克纤维素，加入水6－8毫升，搅拌均匀，涂铺在玻璃板上，在室温下过夜，即可使用。（2）硬板的制备将吸附剂和粘合剂（石膏和淀粉）按一定比例调成糊状，然后用特制的涂铺工具在玻璃板上涂铺成薄层，薄层厚度－毫米(活化后0.1-0.3mm)。4/28/202618常用的涂铺方法：①倾倒法将吸附剂和粘合剂加水调成糊状，将糊状吸附剂倾倒在玻璃板上大致摊开，轻轻振动玻璃板，使糊状物均匀地分布于玻璃板上形成薄层，然后将其放置在水平台上晾干。晾干后放在100－110度的烘箱中活化０.５小时以后，放在干燥器中备用。4/28/202619②刮层法刮层法是在水平台面上放置铺制薄层用玻璃板C，在玻璃板C两侧放置两块玻璃板A和B，A和B较C厚些，相差约－，将调制的糊状吸附剂倾倒在玻璃板C的一端，用有机玻璃尺或边缘光滑的玻璃板沿一个方向将吸附剂刮平，晾干，活化备用。4/28/202620ACB③涂铺器铺层法常用的铺层器是斯塔尔型涂铺器，其使用方法见下图:4/28/2026214/28/202622目前在铺层中经常使用倾倒法铺层，除了使用手工铺层法之外，还有商品预制板出售，包括普通板和高效板，常见的有以玻璃板为载体的氧化铝和硅胶板，以塑料片为载体的聚酰胺薄膜。预制板质量较高，使用方便。但国内预制板的品种及规格较少，因此药典中规定采用的均为手工制板。4/28/202623常见的硬板有：①硅胶硬板以石膏为粘合剂，取市售硅胶G（G代表煅石膏，硅胶G含煅石膏15％）30g，加水60－80mL，滴加乙醇数滴防止气泡产生，置研钵中调成糊状，立即在玻璃板上涂铺成薄层，晾干，活化备用。以淀粉为粘合剂取硅胶，加淀粉1.5g,混匀,加水75mL，置沸水浴上加热，不断搅拌到糊状,然后均匀涂铺在玻璃板上,晾4/28/202624干，活化备用。②氧化铝硬板取氧化铝G（内含煅石膏15％）25g，加水25mL,滴加乙醇数滴，置研钵中调成糊状，然后涂铺成均匀的玻璃板，室温干燥后，根据需要于150－160度干燥1－3小时，备用。（3）薄层板的活化硅胶、氧化铝的活性与其含水量有关，4/28/202625含水量越低，吸附能力越强，其活度越高。因此层析板在使用之前必须经过活化。对于硅胶薄层其活化温度为105~110°C，氧化铝薄层的活化温度为150~200°C，活化后的薄层板在使用之前应放在干燥器中备用。(4)常用的粘合剂及其使用湿法铺层时需要加入粘合剂，常用的粘合剂有：煅石膏、羧甲基纤维素酸钠（CMC）、淀粉和聚乙烯醇。4/28/202626煅石膏用量是吸附剂用量的10－15％，煅石膏和吸附剂混匀后加水调成糊状后铺层。

CMC作粘合剂时，应在CMC中加水使其溶解后配成－1％的水溶液以供调糊使用。淀粉的用量约为吸附剂的5％，把吸附剂和淀粉加水调糊后，应在85°C的水浴中，直接加热数分钟，使淀粉变得有粘性后再铺层。4/28/202627

聚乙烯醇的用量为吸附剂的－％,把聚乙烯醇溶于水中配成％的水溶液以供调糊使用。吸附剂调成糊状时，用水量为吸附剂质量的2－3倍，用倾倒法铺层用水量应多一些，吸附剂和水的质量之比为1：3，用涂铺器铺层时，用水量应少一些以1：2为好。铺好的薄层，应放在水平位置10－20min,待其凝固后放入烘箱，先在60－70°C4/28/202628初步干燥，然后逐步升温之105－110°C,活化半小时，保存在干燥器中备用。有的吸附剂在调糊时，易产生气泡，必须设法除去，否则，在活化时气泡破裂，形成小洞，影响分离。为了防止产生气泡，在调糊时加入数滴乙醇。3.各种特制薄层由于工作需要，各种特制薄层相继出现，这里介绍数种：4/28/202629（1）混合薄层有两种吸附剂混合制成。例如，为了降低硅胶的活度，可在其中加入一定量的硅藻土铺层，也可以用硅胶：氧化铝（1：1）铺层，对糖和醇具有较好的分离效果。（2）酸碱薄层和pH缓冲薄层在分离生物碱和氨基酸时，为了得到更好的分离效果，可在分离时加入稀碱或稀酸，或缓冲溶液代替水制成薄层。4/28/202630

（3）配合薄层用无机试剂如硝酸银的水溶液代替水来铺制的薄层叫配合薄层,在这种薄层上可使不饱和程度不同的脂肪酸得到分离,原因Ag+不和饱和脂肪酸形成配合物,Ag+和含有一个双键的不饱和脂肪酸形成的配合物比含有两个双键的不饱和脂肪酸形成的配合物的稳定性小,因此,在配合薄层上饱和脂肪酸移动的最快,不饱和程度低的脂肪酸移动的较慢,不饱和程度高的脂肪酸移动的最慢。4/28/202631（4）涂布固定液的薄层（分配薄层）把固定相涂布在吸附剂上制成薄层，涂布方法有四种:①调糊法将固定相溶于适当的溶剂中制成溶液，用这种溶液代替水与吸附剂混合调成糊状，涂铺薄层。②浸渍法把固定相溶于易挥发的有机溶剂中，配成一定浓度的溶液，把薄层浸入，取出，在空气中放置使溶剂挥发，而固定相4/28/202632留在薄层上，此法涂布固定相均匀。操作简单，但对于不太牢固的薄层，吸附剂易从玻板上脱落。③展开法把薄层的一端放在含有固定相溶液的层析缸中向上展开一次，此法涂布的固定相不均匀，薄层下端的固定相较多，越往上越少，但不影响分离。④喷雾法把含有固定相的溶液用喷雾器喷到薄层上，这种方法比较简单，但薄层固4/28/202633定相分布不均匀。（5）具有浓缩区的薄层有两种不同的硅胶铺制而成，薄层前面的一段，即为浓缩区，它是由颗粒很大，比表面积很小，吸附能力很弱的硅胶铺制而成，后面的一段薄层由一般的硅胶吸附剂铺成，由于浓缩区的吸附剂极弱，在层析展开时，不论点样情况如何，试样中的各组分都迅速移动至溶剂前沿，于是4/28/202634在薄层交界处形成浓缩带，然后进入第2种薄层进行展开。利用这种薄层点样非常方便，分离效果也大大改善。（6）高效薄层它是由颗粒很小的硅胶和高度惰性的粘合剂铺制而成的质地十分致密、平滑的高效薄层预制板，这种薄层预制板性能十分稳定，层析展开时斑点不扩散，不拖尾，分离清晰，分离效果好。4/28/202635

（7）荧光薄层在制备薄层时，可在吸附剂中加入荧光性物质制成荧光薄层进行分离，由于在紫外线灯照射下，整个薄层显现出荧光，而样品斑点处对紫外线能够产生吸收，不显荧光，故可检出斑点的位置。常用的无机荧光性物质是锰激活的硅酸锌ZnSiO4•Mn，在254nm的紫外线灯照射下能够产生荧光；银激活的ZnS和CdS，4/28/202636ZnS•CdS•Ag在366nm的紫外线照射下能够产生荧光。制备无机荧光薄层的方法是在吸附剂中加入1.5%无机荧光性物质，混合均匀调成糊状铺层。常用的有机荧光性物质是荧光素钠，可在薄层上用喷雾器喷％的荧光素钠的水溶液。第三节薄层层析展开剂的选择

1.展开剂的选择原则作为展开剂的要求：沸点低、较高的纯度、4/28/202637适当的稳定性、粘度低和低毒性。薄层层析中使用最多的是吸附薄层层析，因此我们主要介绍吸附薄层中展开剂的选择.在吸附薄层层析中，样品的分离是由于不同组分与吸附剂的吸附与解析能力的不同引起的，分离的效果主要取决于吸附剂的极性、被分离物质的极性和展开剂的极性。stahl设计了一个用于选择薄层层析条件的简图(三角图形法)4/28/2026384/28/202639

由于吸附剂的选择有限，样品已经给定，因此选择合适的展开剂就是分离能否获得成功的关键,三角图形法仅仅提供了选择展开剂的原则,展开剂选择时首先要查阅文献，在前人文献的基础上再进行适当的改进就可以选择到合适的展开剂。2.展开剂的选择方法

(1)试验方法4/28/202640①微量圆环技术:在没有合适的展开剂参考时，可以首先要选择单一溶剂作展开剂，然后再选择组合溶剂。单一溶剂组分简单，操作方便，分离选择性好。溶剂的选择可采用微量圆环技术应用微量圆环技术可简便快速的比较出被分离物质所在展开剂中的移动速度和最后所得到的分离结果。4/28/202641②蒸气熏使之显色。在同一薄层上采用多种展出剂进行对照试②浸渍法把固定相溶于易挥发的有机溶剂中，配成一定浓度的溶液，把薄层浸入，取出，在空气中放置使溶剂挥发，而固定相现在科研单位不但把薄层层析法作为分离和分析的手段，许多工厂也把薄层层析广泛的用在反应终点控制、工艺条件的选择、产品质量的控制和未知试样的解剖。(1)层析缸应放在水平平稳的实验台上，缸底平正，层析板各部分的倾角应保持一致，以保持展开剂前沿较整齐规则。灵敏度高薄层层析可检出的物质比纸层析高100倍。离难以程度，从而判断这个斑点可能是哪即使同一种吸附剂，但不同厂家，甚至同一厂家的不同批号的产品性质不同。因此层析板在使用之前必须经过活化。根据薄层层析所依据的分离原理可以把薄层层析分为吸附薄层层析、分配薄层层析、离子交换薄层层析和分子排阻薄层层析等，其中最常用的是吸附薄层层析，现以最常见的吸附薄层层析为例介绍其原理：现在科研单位不但把薄层层析法作为分离和分析的手段，许多工厂也把薄层层析广泛的用在反应终点控制、工艺条件的选择、产品质量的控制和未知试样的解剖。如下图所示为显微镜载玻片制成的微型薄层，在微型薄层上点上几个样品，用吸管吸取少量溶剂于薄层斑点上进行展开，观察被分离物质的分离情况。断搅拌到糊状,然后均匀涂铺在玻璃板上,晾预制板质量较高，使用方便。③喷各种显色剂喷雾显色时应将显色剂配成一定浓度的溶液，然后用喷雾器均匀的喷洒在薄层上，喷雾时，喷雾器与薄层之间的距离应在之间。如下图所示为显微镜载玻片制成的微型薄层，在微型薄层上点上几个样品，用吸管吸取少量溶剂于薄层斑点上进行展开，观察被分离物质的分离情况。1－用环己烷进行展开;2－用苯进行展开;3－用氯仿展开4/28/202642②微型薄层可用小玻片铺成薄层，点上试液，用各种认为可能应用的展开剂进行展开试验，从而选择适当的展开剂，再应用于一般薄层，用微型薄层材料和时间都比较节省。（2）展开剂的选择方法

①一般先选择单一溶剂进行试验，然后再选择两种混合溶剂进行试验。例如在硅胶薄层上分离生物碱时，可先用环己烷、苯、氯仿等单一溶剂，再用混合溶剂。如苯：氯仿（9：1或1：1）4/28/202643②如果两种混合溶剂分离效果还不够好，可以考虑加入第三种或第四种组分的混合溶剂.最后加入的第三种或第四种组分的目的是改变展开剂的极性，调整展开剂的酸碱性，以增大试样的溶解度，从而改变分离效果。③一般的讲，结构类似的同系物往往可采用相同组分的展开剂。4/28/202644

例如，在中性氧化铝上分离氨基蒽醌、甲基氨基蒽醌的各种异构体时都可用环己烷：丙酮（3：1）的混合溶剂为展开剂。展开剂的选择尽管非常麻烦，但前人已经做了大量的工作，同系物或结构类似的化合物的分离可以选择相同组分或相似组分的展开剂，因此我们的工作已变得非常简单，只要查阅文献或资料，然后再经过试验就可以选择合适的展开剂。4/28/202645（3）选择和使用展开剂注意事项：

①展开剂要有一定的纯度。有时展开剂中的少量杂质如乙醚中含有少量水或氯仿中含有1％的乙醇等，可大大改变展开剂对混合物的分离能力，所以选择展开剂时一定要注意试剂的规格和生产厂家，否则难以得到重复的结果。

②配制多元展开剂时，各溶剂的体积必须准确加入。加入少量酸、碱或其它溶剂，需用刻度吸管或微量注射器。4/28/202646③多元展开剂中各种溶剂的沸点相差较大时，应该临时配制，并且不能重复使用，以免展开剂的比例改变，影响分离效果。

④配制两种不混溶的展开剂时应在分层后再使用，但在某些时候，展开剂中需要一定含水量，用水饱和展开剂后，应立即分离出带浑浊的有机溶剂层。4/28/202647

⑤选择的展开剂最好是价格便宜、毒性小、挥发度适中，而且是容易购得的普通溶剂。第四节薄层层析的操作方法和展开方式

1.几种特殊形状的薄层为了提高分离效果，缩短分离时间，可以改进薄层的形状（1）径向薄层－可以使两个Rf相近的组分获得较好的分离效果。4/28/202648径向薄层层析点样量可以多一些，展开后呈放射状，分离清晰4/28/202649（2）圆形薄层－可以缩短展开时间4/28/202650（3）S形薄层－增加展开距离

2.点样（1）点样仪器：定性－毛细管；定量－微量注射器;制备分离：滴管。（2）样品溶液常把样品溶于氯仿、甲醇、乙醇等易挥发溶剂中，以便点样后溶4/28/202651剂迅速挥发，减少空气中水分对吸附剂活度的影响；如果样品为水溶液，为了加快点样速度，如该化合物遇热不分解，点样后可以用红外线灯干燥。（3）点样量点样量应根据薄层厚度而定，一般来讲，对于厚度左右的薄层，定性检出时，点样体积为1－10µL，定量测定时点样体积为50－100µL。（4）点样方式和纸层析一样，样品应4/28/202652

a.一般点样b.点成条状c.点成沟槽点成直径为2－3mm的圆点，下面介绍几种特殊的点样方式：4/28/202653

3.展开方式展开方式有上行近水平展开、上行展开、下行展开、环形展开、双向展开。

(1)对于软板，只能采用近水平展开

(2)对于硬板，可以采用各种展开方式。①上行法（同纸层析）②下行法（同纸层析）4/28/202654一般点样b.（三）环境有害物质的分析3－用氯仿展开灵敏度高薄层层析可检出的物质比纸层析高100倍。（3）点样量点样量应根据薄层厚度而定，一般来讲，对于厚度左右的薄层，定性检出时，点样体积为1－10µL，定量测定时点样体积为50－100µL。由于面积一般在15－150mm2之间，测定时可能引入一定的误差。薄层层析法的分类和原理纤维素③喷各种显色剂喷雾显色时应将显色剂配成一定浓度的溶液，然后用喷雾器均匀的喷洒在薄层上，喷雾时，喷雾器与薄层之间的距离应在之间。在薄层展开后，利用薄层色谱扫描仪进行定量测定，但这种仪器价格高，操作复杂，目前尚不能普及，因此不再介绍。分配薄层层析的影响较大，因此在分配薄层层析中保持温度的恒定是必要的。离难以程度，从而判断这个斑点可能是哪3－用氯仿展开淀粉的用量约为吸附剂的5％，把吸附剂和淀粉加水调糊后，应在85°C的水浴中，直接加热数分钟，使淀粉变得有粘性后再铺层。常用的吸附剂：③二次展开对于组成比较复杂的样品，一次展开不能使各组分分离完全，可在第一次展开后，将薄层板从层析缸中取出，让溶剂挥发逸去然后再放入层析缸中，用另一种溶剂或同一种溶剂进行第二次展开。④连续展开－试样中的某些组分比移值较小且分离困难时，可采用连续展开。上行法连续展开,是在特制的层析缸中使薄层的顶部敞于外界,当展开剂上升至薄层顶4/28/202655端即不断向外界挥发时，展开可连续进行。下行法连续展开，是让展开剂连续移动至薄层底部然后滴落至层析缸内。⑤双向展开－对于组成极其复杂的样品双向展开法可以获得较好的分离效果。4/28/2026564.薄层层析注意事项

(1)层析缸应放在水平平稳的实验台上，缸底平正，层析板各部分的倾角应保持一致，以保持展开剂前沿较整齐规则。

(2)层析缸除特殊的要求外应密闭不漏气。使层析在展开剂蒸气饱和的条件下进行展开。

(3)薄层展开时层析缸内展开剂蒸气饱和问题。

(4)温度对吸附薄层层析的影响较小，但对4/28/202657分配薄层层析的影响较大，因此在分配薄层层析中保持温度的恒定是必要的。第五节薄层层析的定性检出在薄层展开后，把薄层板从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿画线，对于有色物质测量斑点的比移值即可进行定性分析，对于无色物质可用物理的或化学的方法使之显色。

1.显色方法和显色剂

(1)显色方法4/28/202658常用的显色方法有三种：①在紫外线灯下观察；②蒸气熏使之显色；③喷各种显色剂。①在紫外线灯下观察常用的紫外线灯是一种汞灯，它一般有两种滤光片，一种能透过254nm的紫外光，另一种能透过366nm的紫外光。4/28/202659

把展开的薄层放在紫外线灯下观察，含有共轭双键的有机物能吸收紫外光呈现暗斑。如果采用硅胶GF涂铺薄层，在紫外灯的照射下整个薄层呈现出黄绿色的荧光，斑点部分变暗，由于在紫外线停止照射后，荧光消失，所以在观察到斑点位置后，应用针在斑点周围刺孔做出记号。4/28/202660②蒸气熏使之显色。常用的试剂有I2、浓NH3·H2O、液体Br2，进行显色时，把这些易挥发的试剂装在密闭的容器中，使它们的蒸气充满整个容器，将已展开并挥发除去溶剂的薄层放在其中，使之显色。③喷各种显色剂喷雾显色时应将显色剂配成一定浓度的溶液，然后用喷雾器均匀的喷洒在薄层上，喷雾时，喷雾器与薄层之间的距离应在之间。4/28/202661

(2)显色剂显色剂的种类很多，大致可分为两类：通用显色剂和专属性显色剂①通用显色剂对于未知物的检验，可以首先考虑通用显色剂，这类显色剂是利用它与被分离组分的氧化还原反应，脱水反应，酸碱反应等显色的，常用的显色剂有下面几种：⒜浓硫酸或50％的硫酸溶液大多数有4/28/202662机化合物喷以此种显色剂后会出现棕色到黑色斑点，这种焦化斑点常常会出现荧光⒝酸碱指示剂例如喷以0.3%溴甲酚绿的80％的甲醇溶液，在绿色背景上呈现黄色斑，表示脂肪族羧酸的存在。⒞5％磷钼酸的乙醇溶液喷后于120°C烘烤，还原性物质呈蓝色斑，再以氨水熏之，背景变为无色。4/28/202663⒟荧光显色剂薄层展开后,喷以荧光显色剂溶液，然后在紫外光灯下观察,不同的物质能在荧光背景下呈现出不同颜色的斑点。常用的荧光显色剂有：％的二氯荧光素，％的荧光素乙醇溶液％的桑色素乙醇溶液，％的罗丹明B乙醇溶液。②专属性显色剂是指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。例如4/28/202664⒜2％2、4－二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120°C加热10min，醛酮在黄橙色背景下显红色或橙色斑。⒝Dragendroff试剂改良后的配方有碱式硝酸铋、酒石酸溶液和KI溶液混合配成，用来检出生物碱和其它含氮化合物。⒞Ehrlich试剂4－二甲基氨基苯甲醛溶液用来检出胺类化合物。⒟％的茚三酮的乙醇溶液用来检出4/28/202665氨基酸及脂肪族伯胺化合物，在白色背景上显粉红色到紫色斑。⒠FeCl3-K3[Fe(CN)6]溶液由的FeCl3和的K3[Fe(CN)6]溶液混合而成，临用前现配。用来检测酚类。⒡25％SbCl3氯仿溶液,用来检出甾族化合物。

2.影响Rf的因素显色后可以根据各个斑点在薄层上的位置计算出Rf,然后根据Rf及显色情况进行定性分4/28/202666析，但影响Rf的因素很多，Rf的重现性很差，影响Rf的因素有：对于吸附薄层层析（1）吸附剂的种类，性质和质量。即使同一种吸附剂，但不同厂家，甚至同一厂家的不同批号的产品性质不同。（2）吸附剂的活度吸附剂在保存过程中会吸附水分改变活度，铺层、点样过程中空气中的水分也会改变吸附剂的活度。4/28/202667（3）展开剂的种类、组成和质量。含有水分等强极性的杂质时，严重影响Rf

。（4）层析缸的大小、形状和饱和程度。（5）展开方式：上行、下行、或径向展开。（6）点样量过多斑点分离不清，Rf变大。（7）温度的影响温度的变化将影响到展开剂的挥发性,影响展开剂的组成,于是影响Rf。4/28/202668

（8）大量杂质存在时,会影响某些组分的Rf。对于分配层析，除了上面的(1)和(2)不影响Rf外，其它各种因素都影响，除此之外还有：

(1)载体上涂布的固定相的种类和数量

(2)层析时的温度除影响展开剂的挥发性外，还影响各个组分在固定相和流动相的分配系数，因而温度显著影响Rf值。4/28/202669

因此，文献上查得的某种组分在一系列条件下的Rf只能供参考，不能作为定性分析的依据，但根据文献的Rf值，能够看出一系列化合物在薄层上的相对位置及分离难以程度，从而判断这个斑点可能是哪一个组分，然后用已知组成的标准试剂，在同一薄层上采用多种展出剂进行对照试验，以鉴定某种成分的存在。4/28/202670六薄层层析的定量测定层析展开后进行定量测定，可以有以下几种方法

1.目视比较半定量法将试液与一系列不同浓度的标准溶液并排点在同一薄层上，层析展开后比较各斑点的大小及颜色的深浅，可借以估计某种组分的大概含量。4/28/202671这是一种半定量方法，方法简单，适应于作为试样中杂质含量的限度检验，例如要检查药物中的某一杂质，先试验在所用层析条件下,该杂质的检出限量，如确定最低检出限量为，若规定药物中杂质最高允许限量为1％，则在点样50µg后进行层析后，不得出现该杂质斑。4/28/2026722.测定斑点面积进行定量测定层析展开后薄层上班点的面积和含量之间存在着一定的关系，因此测定斑点面积，可进行定量测定，关于斑点面积和含量的关系曾有不少报道，由于试样的种类和层析条件不同所得结论也不相同。归纳起来，含量ω和斑点面积之间可以有如下几种不同的线性关系。4/28/202673lgω~A成线性关系

lgω~成线性关系

lgω~lgA成线性关系究竟所测试样适应于哪一种线性关系，需要经过试验确定。测定斑点面积,可用面积测定仪,也可以使用透明纸将斑点大小描绘下来,再将透明纸印在坐标纸上,数出斑点的面积;也可以将描绘出的斑点再转印到质地均匀的较厚的纸上,4/28/202674然后剪下称重，以质量代表面积，等等。由于面积一般在15－150mm2之