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文档简介

小鼠肝组织RNA提取及

RT-PCR

一、试剂及材料1、小鼠肝脏2、DEPC处理过的EP管、PCR管3、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水二、实验原理

TRIZOL：异硫氰酸胍+苯酚裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。三、实验步骤

RNA提取1、新鲜肝组织置EP管中，加200

lTrizol充分研磨后，补加800

lTrizol，枪头吹匀。2、加入200

l氯仿，剧烈震荡15秒，4℃12000g离心15min。3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500

l异丙醇颠倒混匀。4、4℃12000g离心10min。5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50

lDEPC水中。

RT-PCR：RNA的反转录+cDNA的PCRRT-PCR操作步骤

5xPrimeScriptBuffer 2

l①PrimeScriptRTEnzymeMix 0.5

l ②OligodTprimer(50

m) 0.5

l③ Random6mers(`100

m) 1

l④

提取的RNA 0.5

lRNaseFree水

5.5

l⑤ 37℃15min85℃5sec10

lPCR10xPCRBuffer5

ldNTP4

l模板DNA 2

l引物1 2

l引物2 2

lTag酶 0.5

lH2O 34.5

l

50

l

94℃5min94℃°30sec54℃°30sec72℃30sec72℃7min25

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