米氏常数测定(共16张)

底物浓度对酶促反应速度的影响——米氏常数的测定

第1页，共16页。目的要求

（1）了解底物浓度对酶促反应的影响（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法第2页，共16页。实验原理

Km定义：

Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。第3页，共16页。Km的意义

Km是酶的特征常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。

Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。测定Km值是酶学研究的一个重要方法。第4页，共16页。酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示

V[S]v=Km+[S]

v:反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V:最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km:米氏常数（mol/L)

此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。第5页，共16页。双倒数作图法测定Km值：

1Km11

vV[S]V

第6页，共16页。胰蛋白酶的性质

胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基端。用甲醛滴定法测定氨基酸，甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，形成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基酸。第7页，共16页。氨基的测定甲醛滴定法CH2NH2

HCHOCOO-CH2NHCH2OH

HCHOCOO-CH2NH(CH2OH)2

COO-第8页，共16页。试剂和器材1.10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。2.中性甲醛溶液（自己配制）

0.25%酚酞乙醇溶液标准0.1MNaOH溶液。5.胰蛋白酶溶液（已配好）试剂器材：碱式滴定管37度水浴第9页，共16页。一种酶与不同底物反应Km值也不同。（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。V:最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)双倒数作图法测定Km值：Km:米氏常数（mol/L)1MNaOH滴定至微弱而持续的微红色。10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.v=Km+[S]试述底物浓度对酶促反应速度的影响。10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.底物浓度对酶促反应速度的影响中性甲醛溶液（自己配制）在室温时极易挥发，因此实验时，实验室应保持良好的通风，为减少毒害请加快实验速度。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与Km值。1.配制中性甲醛

量取75mL分析纯甲醛加15mL0.25%酚酞乙醇溶液，在大三角瓶中以0.1MNaOH滴至微红，密闭。

2．取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。

操作方法

第10页，共16页。

3．酶反应量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37℃保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）；在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶；第11页，共16页。4．滴定在小三角瓶中分别加10滴酚酞；以0.1MNaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOHmL数。

第12页，共16页。以滴定度（即耗去的NaOHmL数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与Km值。第13页，共16页。

（1）酶促反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。

（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。严格控制准确的酶促反应时间。

注意事项

第14页，共16页。酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示甲醛滴定法在室温时极易挥发，因此实验时，实验室应保持良好的通风，为减少毒害请加快实验速度。2．取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。量取75mL分析纯甲醛加15mL0.（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）；然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。1M标准NaOHmL数。Km:米氏常数