临床生物技术

第一节现代生物技术概述1(一)生物技术的定义生物技术由以下3个相关联的基本要素构成：（1）采用生命科学的理论和技术生物学包括遗传学、生物化学、生理学、生物物理学、分子生物学、微生物学、免疫学、生物信息学探讨的问题从DNA到蛋白质、从染色体到细胞、从生理现象到遗传变异、从个体发育到物种进化、从陆地生物到海洋生物、从大型生物到微生物等（2）应用生物材料或生物系统微生物、植物、动物动植物的器官、组织、细胞、细胞器、生物酶系2（3）通过一定的工程系统获得产品或为社会服务产品：医用蛋白、DNA细胞、组织或器官、动植物新品种、食品、肥料、饲料等社会服务：治疗和预防疾病、环境污染治理、改善自然生态环境基于以上认识，生物技术的定义如下：以现代生命科学理论为基础，结合其他自然科学与工程学原理和技术、设计构建具有特定生物学性状的新型物种或品系，依靠生物体（包括微生物、动植物体、细胞或生物酶系）作为生物反应器，将物料进行加工以提供产品和为社会服务的综合性技术体系。3近代生物技术：通过调控微生物代谢途径积累代谢产物上游过程：优良菌株的筛选及原料加工发酵与转化过程：微生物在大的生物反应器中大量生长并连续生产下游加工过程：目标产物提取、纯化及成品化特点：①产品类型多,包括初级产物、次级产物、生物转化产物、酶促反应产物等。②生产设备规模巨大，发酵罐体积可达上千立方米。③生产技术要求高，无菌技术、补料技术、控制技术。20世纪40年代，青霉素大规模发酵的推动，给发酵工业带来了革命性的变化。61973年美国斯坦福大学的Cohen和加利福尼亚大学的Boyer共同完成的基因转移实验，使得传统生物技术迅速完成了向现代生物技术的飞跃。现代生物技术：以重组DNA技术为核心，其研究内容包括：①重组DNA技术及其他转基因技术；②细胞和原生质融合技术；③酶和细胞固定化技术；④植物脱毒和快速繁殖技术；⑤动物和植物细胞大量培养技术；⑥动物胚胎工程技术；⑦现代微生物发酵技术(高密度发酵、连续发酵和其他新型发酵技术)；⑧现代生物反应工程和分离工程；⑨蛋白质工程；⑩分子进化工程71953年Watson和Crick阐明了DNA双螺旋结构，奠定了分子生物学基础，解开了生命科学史上划时代的一页1957年DNA复制过程包括双螺旋互补链分离得到证实1958年获得了DNA聚合酶I，并利用该酶在试管内成功合成了DNA1965年中国科学家成功合成有生物活性的胰岛素，在世界上首次实现蛋白质人工合成1970年分离得到第一个限制性内切酶；发现逆转录酶生物技术发展史中的重要事件81973年Cohen和Boyer建立了DNA重组技术，为基因工程开启了通往现实的大门，使人们可以按照自己的意愿设计出全新的生命体，完成传统生物技术到现代生物技术的转变1975年利用B细胞杂交技术获得单克隆抗体1976年DNA序列测定技术诞生，世界著名的生物技术公司Genentech成立1977年世界上首例试管婴儿在英国培育成功1978年克美国Genentech公司在大肠艾希菌中成功表达表达了胰岛素1981年第一个单克隆抗体试剂盒在美国获批使用1982年第一个DNA重组技术生产的动物疫苗在欧洲被批准使用91987年1.提出人类基因组计划2.首先报道了细胞点融合现象1990年1.批准第一例临床体细胞基因治疗方案

2.人类基因组计划启动1991年1.噬菌体抗体库技术的建立2.第一次国际基因定位会议，转基因技术被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和隆之后的第四代技术101997年克隆绵羊—多莉问世1998年采用核移植技术培育出了克隆牛，克隆鼠2000年1.完成了果蝇的基因组测序2.绘出拟南芥基因组的完整图谱2003年人类基因组序列图绘制成功，HGP的所有目标全部实现。。。。。。11酶工程现代生物技术基因工程发酵工程蛋白质工程细胞工程生物分离工程（三）生物技术的构成12基因工程基因工程（geneticengineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。影响最大、最核心、发展最迅速、突破性最强13

蛋白质工程（proteinengineering）就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质进行人工修饰、改造与合成，最终获得商业化的产品。蛋白质工程14

酶工程酶工程（enzymeengineering）

就是将生物催化剂（生物酶系或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等）在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。它包括酶制剂的制备，酶的固定化，酶的修饰与改造及酶的发酵生产与分离纯化等方面内容。

15

发酵工程发酵工程（fermentationengineering），是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。16细胞工程细胞工程（cellengineering）

是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。17生物分离工程生物分离工程（bio-sparationengineering）从微生物发酵液、酶促反应液或动植物细胞培养液中将需要的目标产物提取、浓缩、纯化及成品化的一门工程学科，是现代生物技术必不可少的技术环节。分离过程占整个生物生产成本的大部分（70%~80%），决定整个生物加工过程的成败18生物技术各构成成分之间的关系生物技术中的五大工程之间是相互依赖、密切联系、难于分割的。在现代生物技术中基因工程是核心技术，但是基因工程包括蛋白质工程所提供的新的、具有特殊功能的细胞，还必须通过发酵工程或细胞工程来实现它的潜在的经济价值。酶工程中固定化酶和固定化细胞技术，它本来就是从发酵工程中分离出来的一部分，也是同发酵工程密不可分的技术。细胞工程中的动物和植物细胞大量培养技术原理类似于发酵工程。蛋白质工程是酶工程中酶的分子修饰同基因工程相结合的产物。

19基因工程是维系现代生物技术各个研究领域的桥梁和纽带化学工程学微电子技术数学20二、临床生物技术概述临床生物技术是现代生物技术发展的一个重要方面。主要是指生物技术在临床医学中的应用，是以生物学理论为基础，以基因工程技术为核心手段，综合利用细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等多种技术，用于诊断、治疗和预防各种疾病。

21第二节临床生物技术研究内容22基因工程与临床应用一）、基因工程药物许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。23基因工程干扰素干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。干扰素生产车间干扰素分子结构24基因工程干扰素基因工程人干扰素α-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素α-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。25基因工程胰岛素胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。胰岛素分子结构26基因工程胰岛素将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了!胰岛素生产车间27其它基因工程药物

人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产28抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面二)、

基因工程改造抗生素产生菌29（一）、提高抗生素产量

在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种得到的；而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株

原理：在克隆菌中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的正性调节基因）的剂量，使产量提高302.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数

抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别合成途径中的“限速瓶颈”，并设法导入能提高此阶段酶系的基因拷贝数；只要增加的中间产物不对合成途径中的某步骤产生负反馈抑制，就可以增加抗生素的产量。故增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可能提高抗生素产量313.通过调节基因的作用

调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因簇的组成部分。正性调节基因可加速抗生素的合成，负性调节基因可降低抗生素的产量。因此，增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法324.增加抗性基因

抗性基因通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免遭抗生素的杀灭作用；而且有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成。抗性基因经常与生物合成基因连锁，是激活生物合成基因进行转录的必需成分。抗性基因必须先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶与对自身抗性的酶所共同确定33（二）、改善抗生素组分许多抗生素产生菌可以同时产生多种抗生素，这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大。随着对各种抗生素生物合成途径的深入了解及基因重组技术的发展应用基因工程技术可定向改造抗生素产生菌，获得只产生有效成分的菌种34羟基决定了其心脏毒性和肿瘤细胞毒性

ACSChem.Biol.

2012,7,973.35（三）、改造抗生素生产工艺1.抗生素产生菌一般对氧供应较敏感，供氧不足往往是高产发酵的限制因素。在培养过程中，进入液相培养基的氧分子需穿过几层界膜，进入菌体后，再经物理扩散，才能到达相应的呼吸细胞器。若在菌体内导入血红蛋白基因，提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力，从而提高细胞对溶氧的利用率2.在抗生素产生菌中引入耐高温的调节基因，或耐热的生物合成基因，可使发酵温度提高，降低生产成本36（四）、产生杂合抗生素

杂合抗生素：应用遗传重组技术改造菌种，产生新的工程菌，制备的新型抗菌活性化合物1.不同抗生素生物合成基因重组2.生物合成途径中某个酶基因的突变3.在生物合成途径中引入一个酶基因4.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物37PNAS

2012,109,7642.38三)、

分子诊断和基因治疗

分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质及遗传缺陷。39分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测40分子诊断例：镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病引起原因：基因的点突变，丢失了可被MstII或Cvnl切开的一个限制性内切酶位点。正常：两条带携带者：三条带患病：一条带子女1：正常子女2：患病子女3：携带者41例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA，热处理成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；（3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。42基因治疗基因治疗即利用基因工程技术治疗人类遗传性疾病。正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗的转移系统，重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制。“一次性”解除病人的疾苦。43例：重症综合性免疫缺乏症（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。1990年，转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗SCIDSCID患者生存在无菌环境中44动物模型的分类：1、自发性动物模型；2、诱发性动物模型；3、基因工程动物模型；

4、抗疾病型动物模型；5、生物医学模型；四)、

提供人类疾病的动物模型45基因工程动物模型（1）概念

指通过基因重组技术，改变动物的基因或基因组，使动物的遗传特性表现与人类疾病表现相似的动物模型。（2）分类a.转基因小鼠模型：指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞，使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。b.基因敲除小鼠模型：通过同源重组将外源基因定点整合入胚胎干细胞基因组上某一确定的位点，利用修饰的后的干细胞生成嵌合体，再由嵌合体生成基因敲除小鼠。46医学科学研究应用动物模型的意义：1、避免人体实验造成的危害；2、应用动物模型可研究平时不易见到的疾病；烈性传染病（SAS；狂犬病）、中毒病（CO；蛇毒等）、放射病等。3、研究发病率低，潜伏期和病程长的疾病；遗传病（白化病）；动脉硬化；肥胖等。4、可严格控制条件，克服复杂因素；年龄、性别、饮食、文化经济等。5、样品收集方便，实验结果易分析。6、比较人畜共患病病原体对人与动物病变的异同，更加全面了解疾病性质。47（3）基因工程动物模型的优点与不足优点：不但能从动物整体水平和组织器官水平上进行研究，而且还可以深入到细胞水平和分子水平，为发病机制、药物筛选和临床医学研究提供了比较理想的实验体系。缺点：动物机体基因调控机制十分复杂，目前基因工程动物模型提供的信息还很局限。48五、DNA芯片技术DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。1996年底，美国Affymetrix结合照相平板印刷、计算机、半导体、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交和激光共聚扫描等高新技术，研制创造了世界第一块DNA芯片。DNA芯片技术的一般原理49A.用于微阵列芯片制作的点样仪。；B.封装在卡盒中的微阵列芯片;C.用于微阵列芯片荧光标记检测的激光共聚焦扫描器；D.微阵列芯片的局部放大；E.微阵列芯片上固定DNA探针的示意图。图中蓝色的DNA链是预先固定在芯片表面的捕获探针，红色的DNA链是与捕获探针互补的靶DNA分子。50DNA芯片可用于大规模筛查基因突变所引起的疾病；分析基因组及发现新基因等具有很大的优势；

DNA芯片技术用于基因组分析时，具有样品用量小、信息量大、分析方法简易快速、自动化程度高等多项优点，特别适合于寻找新基因、基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。医学、化学、新药开发、司法鉴定、农业技术和食品技术领域也具有广泛的应用；

生物芯片技术的主要应用1998年底，美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一。一些科学家把基因芯片称为“可以随身携带的微型实验室”。51一、医用蛋白的生产一）利用基因工程菌生产医用蛋白①激素类：人胰岛素、人生长素、促肾上腺皮质激素、生长调节素、松弛素等②细胞因子类：干扰素、白细胞介素、表皮生长因子、神经生长因子、肿瘤坏死因子、淋巴细胞毒素、生长激素释放因子等③酶类：尿激酶、葡激酶、超氧化物歧化酶、组织型纤维蛋白原激活剂等④免疫性蛋白：多种抗原、单克隆抗体、基因工程抗体蛋白质工程与临床52二）利用动物细胞生产医用蛋白微生物细胞缺乏对蛋白进行糖基化、磷酸化等后修饰的过程，不能精确折叠天然蛋白的结构，也不能分泌表达，给下游加工过程带来困难。动物细胞培养具有特殊活性的蛋白①病毒疫苗：狂犬疫苗，脊髓灰质炎疫苗②细胞因子类：干扰素、白细胞介素③激素：促红细胞生成素、促卵胞素、促黄体生成素④多种单克隆抗体53蛋白质芯片一般原理蛋白质芯片即蛋白质阵列或蛋白质微阵列将已知的蛋白质或多肽固定在特殊化学处理的固相载体上，根据这些生物分子的识别特性，如抗原与抗体、受体与配体、酶与底物，用标记了酶、荧光素、生物素或放射性核素的蛋白质捕获能与之特异性结合的待测蛋白，从而进行蛋白质表达水平、蛋白质结构等检测。二、蛋白质芯片技术54临床应用①研究蛋白质与蛋白质相互作用特点：高通量②疾病的分子机制研究和疾病诊断了解生理和病理状态下，以及环境或药物刺激下的蛋白质表达和调控③药物筛选及新药研发缩短药物筛选所需要的时间，研究药物作用靶点和作用机制等55一）、

体细胞核移植技术与克隆动物1997年2月英国学者Wilmut采用体细胞核移植克隆法，创造了世界首例来源于哺乳动物体细胞的克隆羊“Dolly”。核移植，就是利用一个动物的体细胞的细胞核（供体核）来取代受精或未受精卵中的细胞核，形成一个重建的“合子”。克隆原意是无性繁殖系。克隆动物就是不经过生殖细胞的受精过程而直接由体细胞获得新的动物个体，这个新个体是原核供体动物的拷贝。细胞工程与临床56277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。57既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体