CN111500570B 特异性转变靶向dna序列的核酸碱基的基因组序列的修饰方法、及其使用的分子复合体 （国立大学法人神户大学）

201580023875.62015.03.04特异性转变靶向DNA序列的核酸碱基的基因本发明涉及特异性转变靶向DNA序列的核酸复合体。本发明提供一种修饰双链DNA的靶向位选择的双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结的至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核2酶、和与选择的双链DNA中的不同的靶核苷酸序列分别进行特异性结合的两种以上的核酸至少一条链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，其中，所述Cas为第10位的Asp残基转变为Ala残基和第840位的His酶、和与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块连接而成位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1其中，双链DNA与复合体的接触，通过向具有所述双链DNA其中，所述Cas为第10位的Asp残基转变为Ala残基和/或第840位的His残基转变为Ala4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述不同的靶核苷6.根据权利要求1所述的方法，其中，双链DNA与复合3其中，所述Cas为第10位的Asp残基转变为Ala残基和/或第840位的His残基转变为Ala20.核酸序列识别模块在制备用于修饰双链DNA的中的不同的靶核苷酸序列分别进行特异性结合的两种以上的核酸序列识别模块连接而成位点的1个以上的核苷酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1其中，所述Cas为第10位的Asp残基转变为Ala残基和第840位的His21.核酸序列识别模块在制备用于修饰双链DNA的中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块连接而成的复合体，与该双链DNA酸缺失或转变为其它的1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的工其中，双链DNA与复合体的接触，通过向具有所述双链DNA其中，所述Cas为第10位的Asp残基转变为Ala残基和/或第840位的His残基转变为Ala436.根据权利要求21或25所述的用途，其中，双5疫系统中起作用的DNA序列CRISPR(ClusteredRegularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，和与CRISPR一起具有重要的作用的核酸酶Cas(CRISPR-使用PPR蛋白质与核酸酶连接而成的人工核酸酶，在该特定序列的附近切割靶基因的方法[0012]非专利文献1：KelvinMEsvelt,HarrisHWang(2013)Genome-scaleengineeringforsystemsand6切割双链DNA或者切割一条链来修饰基因的特定序列的核酸碱基的新型基因组编辑方法，碱基的碱基转变而特异性修饰被靶向化的D于募集Cas蛋白质的RNA(反式-激活crRNA:tracrRNA)连接至包含与待修饰的基因的靶序列作了由编码双链DNA的任意一条或两条链的切割能力已失活的突变Cas蛋白质的DNA(dCas)功地在包括靶序列的关注的基因的几百个核苷酸范围内随机导入突变。与使用对双链DNA的DNA链均不切割的双重突变Cas蛋白质的情况相比，使用切割任意一条链的突变Cas蛋白分别对2个以上的关注的基因中具有的区域进行靶向化，可同时进行多个部位的基因组编的双链DNA中的靶核苷酸序列进行特异性结合的核酸序列识别模块连接而成的复合体，与7通过向具有所述双链DNA的细胞中导入编码所述复合体的[0041][20]核酸修饰酶复合体，该复合体由与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的点(pinpoint)至几百个碱基的范围进行广泛设定，也可以应用于利用向迄今为止几乎不可能进行的特定的限定区域随机导入突变来进行的局8[0045][图1]示出了使用CRISPR-Cas系统的本发明的基因修饰方法的机理的示意性说鳗(Petromyzonmarinus)的PmCDA1脱氨酶的组合的本发明的基因修饰方法的效果进行验[0047][图3]示出了由使用具有切口酶(nickase)活性的Cas9的D10A突变体的CRISPR-行连接的方式构建了多重表达构建体，其中将表达构建体与两种gRNA(以target4及target5的序列为靶)一起导入芽殖酵母的结[0052][图8]示出本发明的基因修饰方法不需要基于标记进行选择的图。确定了序列的[0053][图9]示出根据本发明的基因修饰方法，可以对基因组中多个部位进行同时编辑出了红色(R)及白色(W)菌落的各个5克隆中的靶向部位的测序结果。显示序列中在利用轮廓字体的字母表示的核苷酸中发生了碱基转变。需要说明的是，对刀豆氨酸的反应性上的两个等位基因导入突变的图。图10A显示对于ade1基因(上图)及can1基因的各自的同有25μg/ml利福平(rifampicin)(Rif25)或含有50μg/ml利福平(Rif50)的培养基各自的9核苷酸序列及其附近的核苷酸转变为其它核苷酸，从而修饰该双链DNA的该靶向位点的方酸序列及其附近的核苷酸转变为其它核苷酸的靶核苷酸序列)进行特异性识别并结合的能力的分子或分子复合体。核酸序列识别模块可以通过与靶核苷酸序列结合，使与该模块连接的核酸碱基转变酶在双链DNA的靶向位点发蛋白那样的具有核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的单个[0067]对核酸碱基转变酶的来源没有特别限制，可以使用例如：来自七腮鳗的PmCDA1[0068]对利用本发明的核酸修饰酶复合体的核酸序列识别模块进行识别的双链DNA中的的DNA结合结构域且不具有DNA双链切割能力的片段等，但不限于这些。模块优选包括：[0070]锌指基序由3～6个Cys2His2不同型的锌指单元(1个手指识别约3个碱基)连接而成，可以识别9～18个碱基的靶核苷酸序列。锌指基序可以根据Modularassembly法(NatBiotechnol(2002)20:135-141)、OPEN法(MolCell(2008)31:294-301)、CoDA法(NatMethods(2011)8:67-69)、大肠杆菌单杂交法(NatBiotechnol(2008)26:695-701)等公知的第12及13个氨基酸残基(称为RVD)确定结合稳定性和碱基特异性。由于各个模块的独立子可以利用Openresource的制作方法(REAL法(CurrProtocMolBiol(2012)ChapterAcidsRes(2011)39：e82)等)进行构建，相对容易地设计相对于靶核苷酸序列的TAL效应[0072]对PPR基序而言，构建为使得通过串联的包含35个氨基酸的1个核酸碱基识别PPR[0074]上述任意核酸序列识别模块也可以以上述核酸碱基转变酶的融合蛋白的形式提与核酸碱基转变酶和与内含肽(intein)分别融合，利用各蛋白质合成后的接合将两者连[0075]就包含核酸序列识别模块与核酸碱基转变酶连接而成的复合体(包括融合蛋白)的本发明的核酸修饰酶复合体与双链DNA的接触而言，虽然可以以无细胞体系的酶反应的[0077]由于核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶连接而成的本发明的复合体与DNA双链[0079]编码核酸碱基转变酶的DNA也可以同样地通过以下进行克隆：基于待使用的酶的的cDNA序列(accessionNo.EF094822)，针对CDS的上游及下游设计适当的引物，通过RT-过将编码核酸序列识别模块的DNA和编码核酸碱基转变酶的DNA分别与编码结合结构域或者其结合配偶体的DNA进行融合，或也可以将两种DNA通过与编码分离内含肽的DNA进行融财)KazusaDNA研究所的主页上公开的遗传密码使用频将该DNA连接至适当的表达载体的启动子的下[0084]作为表达载体，可以使用来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)；λ噬菌体等噬菌体；杆状病毒等昆虫病毒载体(例如：CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(Moloney小鼠白血病病毒)[0094]可以通过将包含编码核酸序列识别模块及/或核酸碱基转变酶的DNA表达载体导[0096]作为埃希氏杆菌属，可以使用例如：大肠杆菌(Escherichiacoli)K12？DH1[0097]作为芽孢杆菌属，可以使用例如：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MI114NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC1913、[JournalofExperimentsinMolecularGenetics,431-433,ColdSpringHarbor添加3#-吲哚基丙烯酸的那样的试剂。大肠杆菌的培养通常在约15～约43℃进行。根据需[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505(1980)]、0.5％含酪蛋白氨基酸的SD培养基小必要培养基(MEM)[Science,122，501(1952)]、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)[Virology,8，396(1959)]、RPMI1640培养基[TheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,199，519(1967)]、199培养基[ProceedingoftheSocietyforthe[0118]如上所述操作，可以在细胞内表达核酸序列识别模块和核酸碱基转变酶的复合[0120]由导入至细胞内的表达载体或RNA分子，表达核酸序列识别模块和核酸碱基转变(可以在包含靶核苷酸序列的全部或者一部分或它们的附近的几百个碱基的范围内适当调[0122]与此相对，由于CRISPR-Cas系统是通过相对于靶核苷酸序列互补的指导RNA来识别关注的双链DNA的序列，因此可以通过仅合成可与靶核苷酸序列形成特异性的Hybrid的CRISPR-Cas系统(CRISPR-突变Cas)作为使一条链失活的切割能力的具有切口酶活性的Cas均可以使用。例如，在为SpCas9的情况复合体的形式提供。或者，也可以将核酸碱基转变酶和突变Cas，利用与作为RNA适体的成互补链，接着tracrRNA募集突变Cas，对DNA切割部位识别序列PAM(protospacer的核酸碱基转变酶的作用，使靶向部位(可以在包含靶核苷酸序列的全部或者一部分的几[0129]编码Cas的DNA，可以通过与对于编码核酸碱基转变酶的DNA的上述方法同样的方核酸碱基转变酶的DNA，利用与上述相同的方法和化学合成或PCR法或GibsonAssembly法真核细胞中表达SpCas9的最优化的CDS序列及氨基酸序列示于序列编号5及6。如果将序列[0131]对编码突变CasDNA和编码核酸碱基转变酶的DNA而言，可以连接成使得作为融合补的指导RNA序列与已知的tracrRNA序列(例如：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc变Cas及/或核酸碱基转变酶的DNA进行编码的载体作为模板，通过本身公知的体外转录系[0137]可以将指导RNA-tracrRNA设计成由与靶核苷酸序列互补的序列与已知的为突变Cas使用了具有仅能切割双链DNA之中的一条链的切口酶(nickase)活性的Cas的情iPS细胞，则可以通过在修复了由患者自身的细胞制作的iPS细胞中的病原基因的突变之[0143]在下文的实施例7和随后的实施例中，示出了可以对特定的核苷酸中几乎在针点望导入突变的核苷酸和靶核苷酸序列的位置关系存在规律性即可。使用CRIPR-Cas系统作导入突变的C(或者其相反链的G)在离靶核苷酸序列的5’端2～5个核苷酸的位置。如上所多个靶核苷酸序列而制作序列识别模块并同时使用，突变导入效率大幅升高(图7)。效果靶核苷酸序列，则可以在表达本发明的核酸修饰酶复合体的几乎全部的细胞中导入突变本发明优选的一种实施形态中，可以使用与不同的靶核苷酸序列(可以在1个关注的基因苷酸序列分别形成互补链的2种以上的指导RNA的每一种分别与tracrRNA形成的。另一方宿主细胞内不具有自主复制能力的表达载体(例如：缺乏在宿主细胞中发挥功能的复制起用包括制作以能够控制表达期的形态，包含编码该核酸修饰酶复合体的核酸(在CRISPR-细胞中，可列举温度敏感性(ts)突变阻遏物和控制其的操纵基因(operator)的控制子(利用热休克诱导)、Tet-ON/Tet-OFF类启动子(利用添加或除去四环素或其衍生物进行诱可以实现向靶基因导入突变后的核酸修饰酶复合体的[0159]使用芽殖酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741株(需要亮氨酸及尿嘧啶)，利用标准的YPDA培养基或满足营养要求的撤出成分(Dropout)组成的SD培养基进行培养。培养在从25℃到30℃之间，通过利用琼脂板的静置培养或利用液体培养基的振荡培养进行。2％棉子糖的SR培养基继续培养一夜，进一步接种于将碳源代替为0.2～2％半乳糖的SGal[0164]对诱导表达而言，使用了为半乳糖诱导型且为双向启动子的芽殖酵母pGal1/10连至启动子下游，通过接头序列与脱氨酶基因(来自七腮鳗(Petromyzonmarinus)的列编号14))、Strep-标签(tggagccacccgcagttcgaaaaa；序列编号15(编码18)、Flag标签相连而成的。作为终止子，与来自芽殖酵母的ADH1终止子(序列编号19)及[0165]为了除去各自单侧的DNA链的切割能力，向Cas9中导入了将第10位的天冬氨酸转构的形式配置在SNR52启动子(序列编号23)和Sup4终止子(序列编号24)之间，装配至(ttggccaagtcattcaattt；序列编号28)(target2)及767-786的互补链序列[0167]实施例1利用将CRISPR-Cas的DNA序列识别能力与脱氨酶PmCDA1连接来修饰基因[0168]为了试验利用了脱氨酶和CRISPR-Cas的核酸序列识别能力的本发明的基因组序该gRNA与来自Streptococcuspyogenes的tracrRNA连接而成的嵌合RNA的表达载体，构建表达向来自Streptococcuspyogenes的Cas9(SpCas9)导入突变(D10A及H840A)从而丧失了并测序了CAN1基因区域的序列，结果确认在靶核苷酸序列(target1)内及其附近导入了突从半乳糖表达诱导开始后立即到诱导后6小时的生存细胞在SD平板上的菌落形成能力进行(图6)。因此，根据该方法可以进行点性突变导入。另一方面，结果发现，在后者(nCas9统和胞苷脱氨酶的本基因组编辑体系中，确认到如表1所示，在存在于从靶核苷酸序列和target4为靶。使用PmCDA1作为脱氨酶。确认了不仅在序列的一部分重复的情况下刀豆氨酸)的平板(不含有Leu及Ura的SD平板)上长出的菌落中，随机选出10个测序了CAN1[0187]将芽殖酵母株BY4741株的Ade1基因ORF的3-22位作为第1靶核苷酸序列(Ade1含编码与它们互补的核苷酸序列的两种gRNA与tracrRNA(序列编号7)的嵌合RNA的DNA两于两种基因同时得到期望的突变的比例为40％克隆(10个克隆中占4个克隆)，事实上得到核苷酸序列，将Can1基因ORF的767-786位(互补链)作为第2靶核苷酸序列(Can1target8：ATAACGGAATCCAACTGGGC；序列编号29)，使分别包含编码与它们互补的核苷酸序列的两种码突变Cas9与PmCDA1的融合蛋白的核酸的质粒nCas9D10A-PmCDA1一起，导入BY4741株并[0200]向包含双向启动子区域的StreptococcuspyogenesCas9基因导入D10A及H840A一步制作了同时包括编码与各靶核苷酸序列互补的序列的嵌合gRNA的质粒(全长核苷酸序[0201]首先，将以大肠杆菌galK基因ORF的序列编号33)为靶核苷酸序列导入的质粒，利用钙法或电穿孔法转化至各种大肠杆菌株[0203]下面，以作为必需基因的rpoB基因ORF的1530-1549碱基区域的互补序列(5’-ml利福平(Rif25)及50μg/ml利福平(Rif50)的培养基中选择的菌落进行测序分析，结果确[0207]将利用大肠杆菌进行的实验例示于图12B。检索在大肠杆菌基因组上的胞嘧啶多[0209]将本发明的核酸修饰酶复合体设计为利用高温条件进行表达诱导的方式的质目的在于通过限定表达状态进行控制而将效率最优化，并且减轻副作用(产生宿主的生长感性Rep101的序列示于序列编号36)作为主链(backbone)，使用温度敏感性的λ阻遏物应答下也正常发挥功能(序列编号37)。将dCas9-PmCDA1(序列编号38)连接至Right得控制表达(构建成的表达载体的所有核苷酸序列示于序列编号42)。在30℃以下培养时抗性。对实际LB上得到的菌落(非选择)的8个菌落测序，结果可知，在42℃培养的菌株有DOG的LB(添加氯霉素)平板，利用这些平板准备了在28℃、42℃培养时有或无氯霉素的样[0218]本申请分别基于2014年3月5日及同年9月30日在日本提交的日本特愿2014-43348种类导入部位特异性的突变。另外，能够将突变导入的范围在从一个碱基的针点(pin[0001]SEQUENCELISTING[0002]<110>国立大学法人神户大学(NATIONALUNIVERSITYCORPORATIONKOBEUNIVERSITY)[0003]<120>特异性转变靶向DNA序列的核酸碱基的基因组序列的修饰方法、及其使用的分子复合体(Methodofmodifyinggenomicsequencecomprisingspecifically[0004]convertingnucleobaseintargetedDNAsequenceandmolecularcomplexusedtherefor)[0006]<150>JP2014-043348[0007]<151>2014-03-05[0008]<150>JP2014-201859[0009]<151>2014-09-30[0011]<170>PatentInversion3.5[0015]<213>七腮鳗(Petromyzonmarinus)[0020]atgaccgacgctgagtacgtgagaatccatgagaagttggacatctac48[0021]MetThrAspAlaGluTyrValArgIleHisGluLysLeuAspIleTyr[0023]acgtttaagaaacagtttttcaacaacaaaaaatccgtgtcgcataga96[0024]ThrPheLysLysGlnPhePheAsnAsnLysLysSerValSerHisArg[0026]tgctacgttctctttgaattaaaacgacggggtgaacgtagagcgtgt144[0027]CysTyrValLeuPheGluLeuLysArgArgGlyGluArgArgAlaCys[0029]ttttggggctatgctgtgaataaaccacagagcgggacagaacgtggc192[0030]PheTrpGlyTyrAlaValAsnLysProGlnSerGlyThrGluArgGly[0032]attcacgccgaaatctttagcattagaaaagtcgaagaatacctgcgc240[0033]IleHisAlaGluIlePheSerIleArgLysValGluGluTyrLeuArg[0035]gacaaccccggacaattcacgataaattggtactcatcctggagtcct288[0036]AspAsnProGlyGlnPheThrIleAsnTrpTyrSerSerTrpSerPro[0038]tgtgcagattgcgctgaaaagatcttagaatggtataaccaggagctg336[0039]CysAlaAspCysAlaGluLysIleLeuGluTrpTyrAsnGlnGluLeucgggggaacggcactaaaatcgctaaaArgGlyAsnGlyHisThrLeuLysTrpAlaCysLysLeuTyrTyrgagaaaaatgcgaggaatattgggaacagagataac432GluLysAsnAlaArgAsnGlnGlyLeuTrpAsnLeuArgAspAsnaatgtaatggtaagtgaaagg480GlyValGlyLeuAsnValMetValSerGluHisTyrGlnCysCysArgaaaatattcatcaataatgagaataga528LysIlePheIleGlnSerSerHisAsnGlnLeuAsnGluAsnArgTrpcttgagaagactaaggctgaaaaaagcgagLeuGluLysThrLeuLysArgAlaGluLysArgArgSerGluLeuSerattatgattcaggtaaaaataaccactaagagtcctgctgtt624IleMetIleGlnValLysLeuHisThrThrLysSerProAlaVal200205<210>2<211>208<212>PRT<213>七腮鳗<400>2MetThrAspAlaGluTyrValArgHisGluLysLeuAspTyr15ThrPheLysLysGlnPhePheAsnAsnLysLysSerValSerHisArgCysTyrValLeuPheGluLeuLysArgArgGlyGluArgArgAlaCys4045PheTrpGlyTyrAlaValAsnLysProGlnSerGlyThrGluArgGlyIleHisAlaGluPheSerArgLysValGluGluTyrLeuArgAspAsnProGlyGlnPheThrAsnTrpTyrSerSerTrpSerProCysAlaAspCysAlaGluLysLeuGluTrpTyrAsnGlnGluLeuArgGlyAsnGlyHisThrLeuLysTrpAlaCysLysLeuTyrTyrGluLysAsnAlaArgAsnGlnGlyLeuTrpAsnLeuArgAspAsn[0082]GlyValGlyLeuAsnValMetValSerGluHisTyrGlnCysCysArgLysIlePheIleGlnSerSerHisAsnGlnLeuAsnGluAsnArgTrpLeuGluLysThrLeuLysArgAlaGluLysArgArgSerGluLeuSerIleMetIleGlnValLysLeuHisThrThrLysSerProAlaVal200205<210>3<211>600<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<400>3atggacagcctcttgatgaacaggaagcttaaa48MetAspSerLeuLeuMetAsnArgArgLysPheLeuTyrGlnPheLysaatgtccgctgggctaagggtcgtgagaccgtaAsnValArgTrpAlaLysGlyArgArgGluThrTyrLeuCysTyrValgtgaagaggcgtgacagtgctacagacggtValLysArgArgAspSerAlaThrSerPheSerLeuAspPheGlyTyr4045cttcgcaataagaacggcgtggaaLeuArgAsnLysAsnGlyCysHisValGluLeuLeuPheLeuArgTyratctcggactgggacctagaccctggcgtcacc240IleSerAspTrpAspLeuAspProGlyArgCysTyrArgValThrTrpttcacctcctggagccccgacgcccatgtggccgac288PheThrSerTrpSerProCys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