CN111727038B 肌肉减少症和nad缺乏的风险预测及分级方法 （南安普顿大学）

WO2017109195A1,2017.06.29WO2010142750A1,2010.12.16FR3069434A1,2019.02.012020.09.292020.07.01PCT/EP2019/0508192019.01.14WO2019/141627EN2019.07.25肌肉减少症和NAD缺乏的风险预测及分级方法本发明涉及用于确定个体是否患有肌肉减少症还提供了预测所述个体对营养干预的响应的方21.葫芦巴碱作为生物标志物在制备用于确定个体是否患有肌肉减少症或是否具有出其中所述样本中的葫芦巴碱与所述参考值相比的降低水平是所述个体患有肌肉减少其中所述样本中的葫芦巴碱和邻氨基苯甲酸的比例与所述参考值相比是所述个体患3.根据权利要求2所述的用途，其中来自所述个体的样本中的葫芦巴碱和邻氨基苯甲酸的比例与所述参考值相比的减小是所述个体患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的4.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中肌肉减少症6.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中葫芦巴碱的水平和/或邻氨基苯甲酸的9.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中由10.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中从所述个体获得的所述样本是来源于11.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中从所述个体获得的所述样本是尿液样12.葫芦巴碱作为生物标志物在制备用于预测患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症其中如果所述样本中的葫芦巴碱的水平与所述参考值相比降13.葫芦巴碱和邻氨基苯甲酸作为生物标志物在制备用于预测患有肌肉减少症或具有3出现肌肉减少症的增大风险的个体对用于治疗或预防肌肉减少症的营养组合物的响应的其中如果所述样本中的葫芦巴碱和邻氨基苯甲酸的比例与所述参考值比例相比减小，4义。肌肉减少症预测未来的残疾和死亡，并且于2016年被指定为官方ICD-10疾病编码[0005]设计了MEMOSA(人类肌肉减少症的多族裔分子决定因素)研究以便确定与人类肌[0006]本专利申请的发明人已发现，体内的邻氨基苯甲酸和葫芦巴碱水平以及葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸水平的比例是个体患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的增大风险的[0008]图2，邻氨基苯甲酸的血清水平在肌肉减少症患者中存在差异，并且与瘦肌肉质[0009]图3.葫芦巴碱的血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平的比例在肌肉减少症患者中[0010]图4A和图4B.图4A是肌肉减少图4A的氧化磷酸化基因集的GSEA富集曲线。人类肌肉减少症骨骼肌的RNA测序显示线粒体[0011]图5A和图5B.图5A是肌肉减少5[0012]图6A和图6B.图6A是肌肉减少[0013]图7A和图7B.图7A是肌肉减少图7A的氧化磷酸化基因集的GSEA富集曲线。骨骼肌线粒体功能基因表达与葫芦巴碱:邻氨[0016]图10.葫芦巴碱的血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平的比例与瘦肌肉质量指数[0017]本发明涉及确定个体是否患有肌肉减少症或是否具有出现肌肉减少症的增大风[0020]其中所述样本中的邻氨基苯甲酸与所述参考值相比的增高水平是肌肉减少症或[0024]其中所述样本中的葫芦巴碱与所述参考值相比的降低水平是所述个体患有肌肉[0025]本发明也涉及用于确定个体是否患有肌肉减少症或是否具有出现肌肉减少症的[0029]其中样本中的葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸的比例与参考值相比是个体患有肌肉减少[0030]在一个实施方案中，来自个体的样本中的葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸的比例与参考值相比的减小是个体患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的增大风[0031]本发明也涉及用于确定个体是否患有肌肉减少症或是否具有出现肌肉减少症的6[0035]其中样本中的邻氨基苯甲酸:葫芦巴碱的比例与参考值相比是个体患有肌肉减少[0036]在一个实施方案中，来自个体的样本中的邻氨基苯甲酸:葫芦巴碱的比例与参考值相比的增大是个体患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的增大风[0037]本发明也涉及用于确定个体是否患有肌肉减少症或是否具有出现肌肉减少症的[0041]其中样本中的邻氨基苯甲酸和葫芦巴碱与参考值相比的相对量或组合是个体患[0042]并且其中组合定义为n*f(A)+m*g(B)，其中A和B是葫芦巴碱和邻氨基苯甲酸的浓[0043]例如，组合可定义为1*log2(A)+(-1)*log2(B)＝log2(A/B)或1*log2(A)-2log2考值相比的增大是个体患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的增大[0056]本发明涉及确定个体是否患有肌肉虚耗病症或肌肉疾病或者是否具有出现肌肉7[0059]其中样本中的邻氨基苯甲酸与参考值相比的增高水平或样本中的葫芦巴碱与参考值相比的降低水平是肌肉虚耗病症或肌肉疾病或者具有出现肌肉虚耗病症或肌肉疾病[0060]本发明也涉及用于确定个体是否患有肌肉虚耗病症或肌肉疾病或者是否具有出[0064]其中样本中的葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸的比例与参考值相比是个体患有肌肉虚耗病症或肌肉疾病或者具有出现肌肉虚耗病症或肌肉疾病的增[0065]在一个实施方案中，来自个体的样本中的葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸的比例与参考值相比的减小是个体患有肌肉虚耗病症或肌肉疾病或者具有出现肌肉虚耗病症或肌肉疾[0066]肌肉虚耗病症可能由不被使用、缺少活动(immobilization)、长时间卧床休息、遗传性肌病和营养不良诸如由像皮质类固醇或他汀类药物的药物诱发的杜氏肌营养不良、8[0097]本发明也涉及用于预测患有肌肉虚耗或肌肉疾病或具有出现肌肉虚耗或肌肉疾[0099]本发明也涉及用于预测患有肌肉减少症或具有出现肌肉减少症的增大风险的个9[0121]可基于EWGSOP(老年人肌肉减少症欧洲工作组)的定义，例如如2010年Cruz-[0122]可基于美国国立卫生研究院基金会(FNIH)的定义，例如如2014年Studenski等人低四肢瘦体重(ALM)，具体地讲是男性的ALM:BMI小于0.789，并且女性的ALM:BMI小于[0123]D3-肌酸稀释法是测量肌肉质量的另一种方法。该方法变得越来越广泛地被接受[0128]本发明的方法涉及邻氨基苯甲酸水平和葫芦巴碱水平与邻氨基苯甲酸和葫芦巴[0129]可将来自个体的样本中的邻氨基苯甲酸的水平、葫芦巴碱的水平和/或葫芦巴碱水平:邻氨基苯甲酸水平的比例与同一个体的相同项或一个或多个对照个体群组(群/组)值也可通过如下方式来建立：测定来自一般人群或所选人群中的个体的样本，并且使用统计模型，诸如用于选择限定最佳特异性(最高真阴性率)和灵敏度(最高真阳性率)的阳性标准或受试者工作特征曲线的预测值方法，如Knapp,R.G.和Miller,M.C.(1992)，在引用方式并入本文。括预防和治疗疾病)的食物或食物产品。营养品是从一般以通常不与食物相关联的药物形[0137]根据本发明的营养组合物可包含葫芦巴碱、葫芦巴碱的前体和/或葫芦巴碱的衍[0141]本发明的营养组合物可为适于施用于身体的任何盖仑制剂(galenic)形式，尤其合适润滑剂(例如硬脂酸镁)以及任选的其它添加剂的片[0145]膳食补充剂(也称为食物补充剂或营养补充剂)是旨在补充饮食并提供在人饮食既包括防止性或预防性治疗(预防和/或减缓目标病理学病症或障碍的发展)也包括治愈持和/或促进。这些术语还旨在包括强化或以其他方式增强一种或多种主要的防止性或治[0152]从新加坡对社区健康老年男性居民的2项研究(新加坡肌肉减少症组和社区环境[0153]国家医疗保健组领域特异性研究委员会(NHGDSRB)批准了该研究(参考编号[0155]使用真空采血管和留置式20ga蝶形插管从肘前窝抽取空腹血液样本。将血液在4℃处以3000rpm离心10分钟，然后将血清等分并且在-80℃处冷冻，直至进一步分析。在BEVITAL实验室(挪威卑尔根市(Bergen,Norway))，通过液相色谱之后再通过质谱LC-MS/MS)，测量血清中的邻氨基苯甲酸水平和葫芦巴碱水平。使用具有3个可调节行程长度(13mm,23mm,33mm)的BioPinceTM(安捷泰公司(Angiotech))16G全芯活检针收集20名男性[0156]执行log2转换之后，使用Wilcoxon测试和学生t测试来测试肌肉减少症病例和对照例之间的葫芦巴碱的血清水平、邻氨基苯甲酸的血清水平以及它们的比例(葫芦巴碱的血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平)的差异。在对分析物的血清浓度执行log2转换之后，应用Spearman秩相关性和Pearson相关性，本发明人研究了这些分析物与用于表征肌肉减血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平的比例在肌肉减少症患者中存在差异，并且与瘦肌肉葫芦巴碱的水平/邻氨基苯甲酸的水平的比例(图3)。左图块(panel)表示肌肉减少症患者与对照患者的血清中分析物的log2值。右图块表示血清中的分析物与四肢瘦体重指数示出了分析物的临床变量的拟合回归线，并且灰色区域示出了拟合模型的95％置信区间。报告的P值通过对Log2转换值的学生T统计(病例对照)或Pearson相关性(相关性分析)进行用片段分析仪(先进分析技术公司(AdvancedAnalyticalTechnologies))上的标准灵敏度RNA分析试剂盒来检查RNA质量。所有RNA样本均是同质的，并且通过了质量控制，其中构建的原料，并且使用Ribo-Zero磁性试剂盒(因美纳公司(Illumina))来去除核糖体RNA。使用带Ribo-Zero的TruSeqStrandedRNAHT金试剂盒(因美纳公司)构建测序文库，然后用KAPAHiFiHotStartReadyMix(Kapa生物系统公司(KapaBioSystems))进行13个周期用LabChipGX(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上的DNA高灵敏度试剂盒来控制大小规格。差异表达基因。简而言之，在去除了平均表达低于20个读段的基因之后，通过如实现于TARGETS_V1,4.ALLOGRAFT_REJECTION,5.MTORC1_SIGNALING,6.PEROXISOME,7.ADIPOGENESIS,8.EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION,9.APICAL_JUNCTION,10.G2M_CHECKPOINT,11.BILE_ACID_METABOLISM,12.UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE,13.REACTIVE_OXIGEN_SPECIES_PATHWAY,14.MITOTIC_SPINDLE,15.UV_RESPONSE_UP,16.UV_RESPONSE_DN,17.PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING,18.MYC_TARGETS_V2,19.KRAS_SIGNALING_DN,20.HEDGEHOG_SIGNALING,21.E2F_TARGETS,22.INTERFERON_GAMMA_RESPONSE,23.APICAL_SURFACE,24.TGF_BETA_SIGNALING,25.PROTEIN_SECRETION,26.IL2_STAT5_S平以及葫芦巴碱的血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平的比例的相关性。与葫芦巴碱的血清水平(图5)、邻氨基苯甲酸的血清水平(图6)以及葫芦巴碱的血清水平/邻氨基苯甲酸的血清水平的比例(图7)相关的肌肉基因表达的基因集富集分析(GSEA)。使用平均秩基因集SECRETION,4.ADIPOGENESIS,5.FATTY_ACID_METABOLISM,6.MYC_TARGETS_V1,7.PEROXISOME,8.DNA_REPAIR,9.GLYCOLYSIS,10.MITOTIC_SPINDLE,11.MYOGENESIS,12.INTERFERON_GAMMA_RESPONSE,13.PI3K_AKT_MTOR_SIGNALING,14.WNT_BETA_CATENIN_SIGNALING,15.INTERFERON_ALPHA_RESPONSE,16.ALLOGRAFT_REJECTION,17.BILE_ACID_METABOLISM,18.ANDROGEN_RESPONSE,19.CHOLESTEROL_HOMEOSTAS[0167]图6A的关键：1.OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION,2.FATTY_ACID_METABOLISM,3.ADIPOGENESIS,4.G2M_CHECKPOINT,5.BILE_ACID_METABOLISM,6.PEROXISOME,[0168]图7A的关键：1.OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION,2.FATTY_ACID_METABOLISM,3.ADIPOGENESIS,4.MTORC1_SIGNALING,5.PEROXISOME,6.PROTEIN_SECRETION,7.MYOGENESIS,8.G2M_CHECKPOINT,9.MYC_TARGETS_V1,10.BILE_ACID_METABOLISM,11.DNA_REPAIR,12.CHOLESTEROL_HOMEOSTASIS,13.KRAS_SIGNALING_DN,1[0172]为了确定NAD水平是否可能是肌肉减少症肌肉的线粒体标记的上游触发因素，测量老龄人肌肉活检材料中的NAD。如2018年Dall等人所述，测量人类肌肉活检物的NAD+水在100mMNa2HPO4pH8.0中稀释250倍。将100μL稀释样本与100μL反应混合物(100mM水平在患有肌肉减少症的人的骨骼肌中的这种大幅降低首次将低NAD+水平与人类的年龄[0177]这70名参与者是赫特福德郡肌肉减少症研究(HertfordshireSarcopeniaStudyX线吸收测量法(DXA)扫描确定的身体[0178]使用真空采血管和留置式20ga蝶形插管从肘前窝抽取空腹血液样本。将血液在4℃处以3000rpm离心10分钟，然后将血清等分并且在-80℃处冷冻，直至进一步分析。在BEVITAL实验室(挪威卑尔根市(Bergen,Norway))，通过液相色谱之后再通过质谱LC-MS/[0180]图10表明，葫芦巴碱的血清水平:邻氨基苯甲酸的血清水平比例与通过四肢瘦体物的比例(葫芦巴碱:邻氨基苯甲酸)log2值(x轴)与四肢瘦体重指数(ALMi)(y轴)的相关邻氨基苯甲酸)的拟合回归线。根据简单的线性回归，我们获得了0.23的皮尔森相关性系workwithhigh-throughputsequencingdata.Bioinformatics31,166-169.(HTSeq--10codeforsarcopenia.Journalofcachexia,sarcopeniaandmuscle7,512-514(欢consensusreportoftheAsianWorkingGroupforSarcopenia.Journalofthemusclemass:estimationbycreatine(methyl-d3)dilutioninhumans.JApplSarcopenia:Europeanconsensusondefinitionanddiagnosis:ReportoftheEuropeanWorkingGrouponSarcopeniainOlderPeople.AgeAgeing39,412-423(肌Treebak,JT，HepaticNAD(+)levelsandNAMPTabundanceareunaffectedduringprolongedhigh-fatdietconsumptioninC57BL/6JBomTacmice.MolecularandCellularEndocrinology(2018)S0303-7207(18)30048(C57BL/6JBomTac小鼠在长期食用sampleandobservationallevelvariabilityimprovespowerinRNA-seqanalyses.Nucleicacidsresearch43,e97(为什么加权？对样本建模和观测性水平变化packagefordifferentialexpressionanalysisofdigitalgeneexpressiondata.Bioinformatics26,139-140(edgeR：用于数字基因表达数据的差异表达分析的[0191]Smyth,G.K.(2004年)，Linearmodelsandempiricalbayesmethodsforassessingdifferentialexpressioninmicroarrayexperiments.Statisticalapplicationsingeneticsandmolecularbiology3,Article3(用于评估微阵列实验MD、DamTT、VassilevaMdescription,conferencerecommendations,andfinalestimates.JGerontolABioltotalbodycreatinepoolsizeandskeletalmuscl>-creatinedilutionmethod.JCachexiaSarcopeniaMuscle.Jun25(使用D<sub>3