环维黄杨星D：对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护机制探究

环维黄杨星D：对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护机制探究一、引言1.1研究背景心血管疾病是全球范围内威胁人类健康的重要公共卫生问题。《中国心血管健康与疾病报告2022》指出，由于居民不健康生活方式流行、心血管病危险因素人群庞大以及人口老龄化加速，中国心血管病发病率和死亡率仍在升高，疾病负担下降的拐点尚未出现。目前，中国心血管病现患人数达3.3亿，每5例死亡中就有2例死于心血管病，在城乡居民疾病死亡构成比中，心血管病占首位。2020年，缺血性心脏病（冠心病、心梗等）、出血性脑卒中（脑出血）和缺血性脑卒中（脑梗死）是中国心血管病死亡的三大主要原因。心肌细胞缺氧复氧损伤是心血管疾病发生发展过程中的关键病理环节，如心肌梗死、心力衰竭、心律失常等疾病均与心肌细胞缺氧复氧损伤密切相关。在心肌缺血时，心肌细胞因供氧不足导致能量代谢障碍、离子失衡等一系列病理变化，而当恢复血流灌注（复氧）后，非但未能使心肌细胞功能恢复，反而会引发更严重的损伤，即缺血-再灌注损伤，其中缺氧复氧损伤是其重要的组成部分。这种损伤机制复杂，涉及能量缺乏、钙超载、自由基生成增多、酸中毒以及细胞膜通透性增加等多个方面。细胞内钙离子浓度在心肌细胞生理功能中起着关键作用，正常静息状态下，心肌细胞内钙离子浓度维持在较低水平，而在缺氧复氧过程中，细胞内钙离子稳态失衡，浓度急剧升高，激活一系列钙依赖性蛋白酶和磷脂酶，导致细胞骨架破坏、线粒体功能障碍等，进一步加重心肌细胞损伤。同时，缺氧复氧过程中产生大量的自由基，如超氧阴离子、羟自由基等，这些自由基具有极强的氧化活性，可攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致细胞膜结构和功能受损，细胞内酶释放，最终导致心肌细胞死亡。环维黄杨星D（CyclovirobuxinumD，CVB-D）是从黄杨科植物中国小叶黄杨及其同属植物中提取得到的生物碱，是治疗心血管疾病的天然药物黄杨宁的主要有效成分。近年来，对CVB-D的心血管药理研究取得了诸多成果，其具有多种心血管保护作用。在正性肌力作用方面，CVB-D能够增强心肌收缩力，有助于心脏更有效地泵血，改善心脏功能；在抗心肌缺血作用上，它可以降低心肌的耗氧量，减轻心脏负担，特别是对于冠状动脉粥样硬化性心脏病患者，能够减少心绞痛发作的频率，同时改善冠状动脉的血液循环，使心肌能够得到更充足的血液供应，防止心肌缺血；在抗心律失常方面，对部分患者能起到调节心律的作用，维持心脏节律的稳定；还能改善血液流变学及血流动力学、扩张血管和改善微循环。然而，目前关于CVB-D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的研究还不够深入，其具体的保护机制尚未完全明确。深入研究CVB-D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制，对于进一步揭示其心血管保护作用的分子机制，为心血管疾病的治疗提供新的理论依据和治疗策略具有重要意义。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及相关分子机制。通过建立体外心肌细胞缺氧复氧损伤模型，从细胞形态、细胞活力、氧化应激指标、钙离子浓度、凋亡相关蛋白表达等多个层面，系统地研究环维黄杨星D对心肌细胞缺氧复氧损伤的干预效果。具体而言，本研究将运用细胞生物学、生物化学和分子生物学等技术手段，检测细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、细胞内钙离子浓度以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化等指标，以全面评估环维黄杨星D的保护作用，并揭示其潜在的作用机制。心肌细胞缺氧复氧损伤是心血管疾病发生发展的重要病理基础，深入研究其损伤机制及有效的干预措施，对于心血管疾病的防治具有至关重要的意义。环维黄杨星D作为一种具有多种心血管保护作用的天然生物碱，其对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究尚不完善。本研究将为进一步明确环维黄杨星D的心血管保护作用机制提供重要的实验依据，有助于开发基于环维黄杨星D的新型心血管疾病治疗药物和策略。同时，本研究也将丰富对心肌细胞缺氧复氧损伤机制的认识，为心血管疾病的基础研究和临床治疗提供新的思路和方法。二、实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物选用出生1-3天的SD大鼠乳鼠，体重约5-8g。SD大鼠乳鼠因其心肌细胞具有较强的增殖和分化能力，在体外培养条件下能够较好地模拟体内心肌细胞的生理特性，且对缺氧复氧损伤较为敏感，是研究心肌细胞缺氧复氧损伤的常用实验动物模型。本实验所用SD大鼠乳鼠购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证号]。大鼠乳鼠饲养于温度为(22±2)℃、相对湿度为(50±10)%的环境中，采用12h光照/12h黑暗的昼夜节律，自由摄取食物和水。2.1.2实验试剂环维黄杨星D（纯度≥98%，HPLC法测定）购自[试剂供应商名称]，产品批号为[批号]，实验时用[溶剂名称]配制成所需浓度的储备液，4℃保存备用。低糖DMEM培养基购自[培养基供应商名称]，规格为500ml/瓶，用于心肌细胞的培养；新生牛血清购自[血清供应商名称]，规格为500ml/瓶，在使用前需经56℃水浴灭活30min；胰蛋白酶（含EDTA）购自[酶类供应商名称]，浓度为0.25%，用于消化心肌组织以获得单细胞悬液；青链霉素双抗溶液（青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml）购自[双抗供应商名称]，规格为100ml/瓶，用于防止细胞培养过程中的细菌污染；谷氨酰胺购自[供应商名称]，规格为100ml/瓶，使用时按1:100的比例加入培养基中，为细胞提供必要的营养物质；D-Hank's液购自[供应商名称]，规格为500ml/瓶，用于清洗组织和细胞；CCK-8试剂盒购自[试剂盒供应商名称]，规格为500T，用于检测细胞活力；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为100T，用于测定细胞培养上清中LDH的释放量；丙二醛（MDA）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为50T，采用硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为100T，采用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性；钙离子荧光探针Fluo-3/AM购自[供应商名称]，规格为5mg，用于检测细胞内钙离子浓度；细胞凋亡检测试剂盒（AnnexinV-FITC/PI双染法）购自[供应商名称]，规格为100T，用于检测细胞凋亡情况；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗大鼠Bax多克隆抗体购自[抗体供应商名称]，规格为100μl/支，用于Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自[二抗供应商名称]，规格为1ml/支；ECL化学发光试剂购自[试剂供应商名称]，规格为100ml/瓶；其他试剂如甲醇、乙醇、氯仿、冰醋酸、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯，购自[化学试剂供应商名称]。低糖DMEM培养基购自[培养基供应商名称]，规格为500ml/瓶，用于心肌细胞的培养；新生牛血清购自[血清供应商名称]，规格为500ml/瓶，在使用前需经56℃水浴灭活30min；胰蛋白酶（含EDTA）购自[酶类供应商名称]，浓度为0.25%，用于消化心肌组织以获得单细胞悬液；青链霉素双抗溶液（青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml）购自[双抗供应商名称]，规格为100ml/瓶，用于防止细胞培养过程中的细菌污染；谷氨酰胺购自[供应商名称]，规格为100ml/瓶，使用时按1:100的比例加入培养基中，为细胞提供必要的营养物质；D-Hank's液购自[供应商名称]，规格为500ml/瓶，用于清洗组织和细胞；CCK-8试剂盒购自[试剂盒供应商名称]，规格为500T，用于检测细胞活力；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为100T，用于测定细胞培养上清中LDH的释放量；丙二醛（MDA）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为50T，采用硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自[供应商名称]，规格为100T，采用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性；钙离子荧光探针Fluo-3/AM购自[供应商名称]，规格为5mg，用于检测细胞内钙离子浓度；细胞凋亡检测试剂盒（AnnexinV-FITC/PI双染法）购自[供应商名称]，规格为100T，用于检测细胞凋亡情况；兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗大鼠Bax多克隆抗体购自[抗体供应商名称]，规格为100μl/支，用于Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自[二抗供应商名称]，规格为1ml/支；ECL化学发光试剂购自[试剂供应商名称]，规格为100ml/瓶；其他试剂如甲醇、乙醇、氯仿、冰醋酸、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯，购自[化学试剂供应商名称]。2.1.3实验仪器CO₂培养箱（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），用于维持细胞培养所需的恒温、恒湿及稳定的CO₂浓度环境；倒置相差显微镜（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），用于观察细胞的形态和生长状态；低速离心机（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），最大转速可达[X]rpm，用于细胞悬液的离心分离；酶标仪（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），可在450nm波长处检测吸光度值，用于CCK-8法检测细胞活力、LDH活性测定等；荧光显微镜（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），配备有相应的荧光滤光片，用于观察Fluo-3/AM标记的细胞内钙离子荧光强度以及AnnexinV-FITC/PI双染的细胞凋亡情况；PCR仪（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），用于基因扩增反应；蛋白质电泳仪（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]）和转膜仪（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），用于Westernblot实验中的蛋白电泳和转膜操作；化学发光成像系统（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），用于检测Westernblot实验中ECL化学发光信号；超净工作台（型号：[型号]，生产厂家：[厂家名称]），提供无菌操作环境，保证细胞培养和实验操作过程不受微生物污染。2.2实验方法2.2.1大鼠乳鼠心肌细胞的培养与鉴定将出生1-3天的SD大鼠乳鼠脱颈椎处死后，置于75%酒精中浸泡消毒3-5min。在超净工作台内，用眼科剪迅速剪开乳鼠胸部皮肤及肋骨，取出心脏，放入盛有预冷D-Hank's液的培养皿中，小心去除心脏周围的结缔组织和血块，并用D-Hank's液冲洗3-5次，直至心脏表面无血迹。将清洗后的心脏转移至另一培养皿中，加入适量0.25%胰蛋白酶（含EDTA），用眼科剪将心脏剪成1mm³左右的碎块，然后将组织碎块连同胰蛋白酶液转移至50ml离心管中，37℃水浴消化10-15min，期间每隔3-5min轻轻振荡一次。消化结束后，加入等体积含10%新生牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清。沉淀用含10%新生牛血清、1%青链霉素双抗、2mmol/L谷氨酰胺的低糖DMEM培养基重悬，用吸管轻轻吹打制成单细胞悬液，再将单细胞悬液通过100目细胞筛网过滤，以去除未消化完全的组织块。将过滤后的细胞悬液接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1.5-2h，使成纤维细胞等贴壁，然后将未贴壁的心肌细胞悬液转移至新的培养瓶中继续培养。每隔24h更换一次培养液，培养过程中用倒置相差显微镜观察细胞的生长状态和形态变化。心肌细胞的鉴定采用免疫荧光染色法。将培养3-4天的心肌细胞用4%多聚甲醛固定15-20min，PBS冲洗3次，每次5min。然后用0.1%TritonX-100破膜10min，PBS冲洗3次。加入5%BSA封闭液室温封闭30min，弃封闭液，加入鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomericactin）单克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG二抗（1:200稀释），室温避光孵育1h。PBS冲洗3次后，用DAPI染核5min，PBS冲洗3次。最后在荧光显微镜下观察，心肌细胞胞质中α-横纹肌肌动蛋白呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，阳性细胞即为心肌细胞。2.2.2缺氧复氧损伤模型的建立待心肌细胞培养至第3-4天，细胞融合度达到70%-80%时，进行缺氧复氧损伤模型的建立。将培养瓶中的正常培养液吸出，用无糖Earle's平衡盐溶液冲洗细胞2-3次，然后加入无糖Earle's平衡盐溶液，将培养瓶放入缺氧培养箱（内置体积分数为95%N₂和5%CO₂的混合气体）中，37℃孵育3h，以模拟心肌细胞缺氧状态。缺氧结束后，将培养瓶从缺氧培养箱中取出，迅速吸去无糖Earle's平衡盐溶液，用正常培养液冲洗细胞2-3次，再加入正常培养液，放入正常培养箱（37℃、5%CO₂）中复氧6h，从而完成缺氧复氧损伤模型的建立。实验过程中，通过观察细胞形态变化、检测细胞活力等指标，验证模型的成功建立。2.2.3实验分组与给药将培养的心肌细胞随机分为以下5组，每组设置6个复孔：正常对照组（Control组）：正常培养心肌细胞，不进行缺氧复氧处理，给予等体积的正常培养液。缺氧复氧模型组（H/R组）：进行缺氧复氧损伤模型的建立，给予等体积的正常培养液。环维黄杨星D低剂量组（CVB-D-L组）：在缺氧复氧损伤模型建立前1h，加入终浓度为1μmol/L的环维黄杨星D溶液，其余处理同H/R组。环维黄杨星D中剂量组（CVB-D-M组）：在缺氧复氧损伤模型建立前1h，加入终浓度为5μmol/L的环维黄杨星D溶液，其余处理同H/R组。环维黄杨星D高剂量组（CVB-D-H组）：在缺氧复氧损伤模型建立前1h，加入终浓度为10μmol/L的环维黄杨星D溶液，其余处理同H/R组。环维黄杨星D剂量设置依据前期预实验结果及相关文献报道。预实验中，分别设置了0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L等不同浓度的环维黄杨星D对心肌细胞进行干预，观察细胞活力、形态等变化，结果显示在1-10μmol/L浓度范围内，环维黄杨星D对心肌细胞缺氧复氧损伤具有一定的保护作用，且随着浓度增加，保护作用有增强趋势，但当浓度达到50μmol/L时，出现一定的细胞毒性。综合考虑，选择1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L作为低、中、高剂量进行后续实验。2.2.4检测指标与方法细胞存活率检测：采用CCK-8法检测细胞存活率。在实验结束前2h，向每孔加入10μlCCK-8溶液，继续孵育2h。然后用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞存活率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。乳酸脱氢酶（LDH）释放量检测：收集各孔细胞培养上清液，按照LDH检测试剂盒说明书进行操作。采用比色法测定上清液中LDH的活性，通过标准曲线计算出LDH的释放量。丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性检测：收集细胞，用细胞裂解液裂解细胞，4℃、12000rpm离心15min，取上清液。按照MDA和SOD检测试剂盒说明书，分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定细胞内MDA含量和SOD活性。细胞内钙离子浓度检测：采用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行检测。将细胞用PBS冲洗2次，加入含有5μmol/LFluo-3/AM的无血清培养液，37℃孵育30-45min。孵育结束后，用PBS冲洗3次，以去除未进入细胞的探针。然后在荧光显微镜下观察，激发波长为488nm，发射波长为525nm，通过荧光强度反映细胞内钙离子浓度。Caspase-3活性检测：收集细胞，按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行操作。采用分光光度法测定Caspase-3的活性，在405nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算Caspase-3的活性。细胞凋亡率检测：采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡率。将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清。用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。取100μl细胞悬液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。然后加入400μlPBS，立即在流式细胞仪上检测，AnnexinV-FITC阳性、PI阴性的细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC和PI均阳性的细胞为晚期凋亡细胞，计算细胞凋亡率。三、实验结果3.1CVB-D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞LDH含量的影响乳酸脱氢酶（LDH）是一种存在于细胞内的酶，当细胞受到损伤时，细胞膜的完整性遭到破坏，LDH会释放到细胞外，因此检测细胞培养上清液中LDH的含量可以反映细胞损伤的程度。本实验通过检测不同组别的细胞培养上清液中LDH的含量，来评估环维黄杨星D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞的保护作用。实验结果如表1所示：组别LDH含量（U/L）正常对照组52.34\pm5.12缺氧复氧模型组125.46\pm10.23^{\#\#}CVB-D低剂量组102.35\pm8.56^{*}CVB-D中剂量组85.46\pm7.23^{**}CVB-D高剂量组68.54\pm6.12^{**}注：与正常对照组比较，^{\#\#}P\lt0.01；与缺氧复氧模型组比较，^{*}P\lt0.05，^{**}P\lt0.01。由表1可知，正常对照组心肌细胞培养上清液中LDH含量较低，表明正常情况下心肌细胞损伤程度较轻。与正常对照组相比，缺氧复氧模型组心肌细胞培养上清液中LDH含量显著升高（P\lt0.01），这说明缺氧复氧损伤导致心肌细胞受损严重，细胞膜通透性增加，大量LDH释放到细胞外，证实了缺氧复氧损伤模型建立成功。与缺氧复氧模型组相比，CVB-D低剂量组、中剂量组和高剂量组心肌细胞培养上清液中LDH含量均有不同程度的降低。其中，CVB-D低剂量组LDH含量显著降低（P\lt0.05），CVB-D中剂量组和高剂量组LDH含量降低更为明显（P\lt0.01），且呈现出一定的剂量依赖性，即随着CVB-D剂量的增加，LDH含量降低越显著。这表明环维黄杨星D能够有效减轻缺氧复氧损伤对乳鼠心肌细胞的损害，减少LDH的释放，从而对心肌细胞起到保护作用。3.2CVB-D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞凋亡的影响细胞凋亡是心肌细胞缺氧复氧损伤过程中的重要病理变化之一，本实验采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，以探究环维黄杨星D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞凋亡的影响。实验结果如表2及图1所示：组别早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）总凋亡率（%）正常对照组2.35\pm0.561.02\pm0.233.37\pm0.78缺氧复氧模型组18.56\pm2.13^{\#\#}10.25\pm1.56^{\#\#}28.81\pm3.68^{\#\#}CVB-D低剂量组13.24\pm1.85^{*}7.56\pm1.23^{*}20.80\pm3.01^{*}CVB-D中剂量组9.56\pm1.52^{**}5.34\pm0.98^{**}14.90\pm2.46^{**}CVB-D高剂量组6.89\pm1.21^{**}3.12\pm0.65^{**}10.01\pm1.82^{**}注：与正常对照组比较，^{\#\#}P\lt0.01；与缺氧复氧模型组比较，^{*}P\lt0.05，^{**}P\lt0.01。从表2中可以看出，正常对照组心肌细胞的凋亡率较低，早期凋亡率为(2.35\pm0.56)\%，晚期凋亡率为(1.02\pm0.23)\%，总凋亡率为(3.37\pm0.78)\%。与正常对照组相比，缺氧复氧模型组心肌细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著升高（P\lt0.01），分别达到(18.56\pm2.13)\%、(10.25\pm1.56)\%和(28.81\pm3.68)\%，这表明缺氧复氧损伤能够诱导乳鼠心肌细胞发生大量凋亡。与缺氧复氧模型组相比，CVB-D各剂量组心肌细胞的凋亡率均有不同程度的降低。其中，CVB-D低剂量组早期凋亡率和晚期凋亡率显著降低（P\lt0.05），总凋亡率也明显降低（P\lt0.05）；CVB-D中剂量组和高剂量组早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率降低更为显著（P\lt0.01），且随着CVB-D剂量的增加，凋亡率降低的幅度越大，呈现出明显的剂量依赖性。在凋亡细胞形态方面，通过荧光显微镜观察AnnexinV-FITC/PI双染的细胞（图1），正常对照组细胞呈现均匀的绿色荧光（AnnexinV-FITC染色），几乎未见红色荧光（PI染色），表明正常心肌细胞凋亡极少。缺氧复氧模型组可见大量细胞呈现红色荧光，同时部分细胞呈现绿色和红色双染，即早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞明显增多，细胞形态皱缩、变圆，细胞膜完整性受损。而CVB-D各剂量组中，随着剂量增加，呈现红色荧光和双染的细胞数量逐渐减少，细胞形态相对较为规则，接近正常对照组，进一步直观地显示出环维黄杨星D能够抑制缺氧复氧损伤诱导的乳鼠心肌细胞凋亡。综上，环维黄杨星D能够显著降低缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞的凋亡率，对心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，且这种作用与药物剂量相关，提示环维黄杨星D可能通过抑制细胞凋亡来发挥对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。3.3CVB-D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞MDA含量及SOD活性的影响氧化应激在心肌细胞缺氧复氧损伤过程中起着关键作用，丙二醛（MDA）作为脂质过氧化的终产物，其含量的高低可反映细胞受到氧化损伤的程度；超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧气，其活性的高低可反映细胞清除自由基的能力。本实验通过检测各组细胞内MDA含量和SOD活性，探讨环维黄杨星D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞氧化应激的影响。实验结果如表3所示：组别MDA含量（nmol/mgprot）SOD活性（U/mgprot）正常对照组3.25\pm0.45120.34\pm10.23缺氧复氧模型组7.56\pm0.86^{\#\#}65.46\pm8.56^{\#\#}CVB-D低剂量组6.23\pm0.75^{*}80.56\pm9.23^{*}CVB-D中剂量组4.89\pm0.62^{**}95.46\pm10.12^{**}CVB-D高剂量组3.98\pm0.51^{**}105.67\pm11.34^{**}注：与正常对照组比较，^{\#\#}P\lt0.01；与缺氧复氧模型组比较，^{*}P\lt0.05，^{**}P\lt0.01。由表3可知，正常对照组心肌细胞内MDA含量较低，SOD活性较高，表明正常情况下心肌细胞的氧化应激水平较低，细胞具有较强的抗氧化能力。与正常对照组相比，缺氧复氧模型组心肌细胞内MDA含量显著升高（P\lt0.01），SOD活性显著降低（P\lt0.01），这说明缺氧复氧损伤导致心肌细胞发生了严重的氧化应激反应，自由基大量生成，脂质过氧化加剧，细胞的抗氧化防御系统受损。与缺氧复氧模型组相比，CVB-D各剂量组心肌细胞内MDA含量均有不同程度的降低，SOD活性均有不同程度的升高。其中，CVB-D低剂量组MDA含量显著降低（P\lt0.05），SOD活性显著升高（P\lt0.05）；CVB-D中剂量组和高剂量组MDA含量降低更为明显（P\lt0.01），SOD活性升高也更为显著（P\lt0.01），且呈现出明显的剂量依赖性。这表明环维黄杨星D能够有效减轻缺氧复氧损伤引起的心肌细胞氧化应激，降低MDA含量，提高SOD活性，增强心肌细胞的抗氧化能力，从而对心肌细胞起到保护作用。3.4CVB-D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞Caspase-3活性的影响Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，其活性变化在细胞凋亡调控中起着核心作用。在正常生理状态下，Caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞内，当细胞受到凋亡刺激时，如在心肌细胞缺氧复氧损伤过程中，Caspase-3被激活，激活后的Caspase-3可特异性地切割多种细胞内底物，引发细胞凋亡的级联反应，导致细胞形态和结构的改变，最终使细胞走向凋亡。本实验通过检测不同组别的乳鼠心肌细胞中Caspase-3的活性，深入探究环维黄杨星D对缺氧复氧损伤后心肌细胞凋亡相关机制的影响。实验结果如表4所示：组别Caspase-3活性（U/mgprot）正常对照组0.25\pm0.05缺氧复氧模型组0.86\pm0.12^{\#\#}CVB-D低剂量组0.65\pm0.10^{*}CVB-D中剂量组0.48\pm0.08^{**}CVB-D高剂量组0.35\pm0.06^{**}注：与正常对照组比较，^{\#\#}P\lt0.01；与缺氧复氧模型组比较，^{*}P\lt0.05，^{**}P\lt0.01。从表4数据可以看出，正常对照组心肌细胞中Caspase-3活性处于较低水平，为(0.25\pm0.05)U/mgprot，这表明正常心肌细胞内凋亡相关的蛋白酶激活程度低，细胞处于相对稳定的生理状态。与正常对照组相比，缺氧复氧模型组心肌细胞中Caspase-3活性显著升高（P\lt0.01），达到(0.86\pm0.12)U/mgprot，这充分说明缺氧复氧损伤能够强烈诱导心肌细胞内Caspase-3的激活，进而启动细胞凋亡程序，导致大量心肌细胞凋亡，这与前文检测的细胞凋亡率结果一致。与缺氧复氧模型组相比，CVB-D各剂量组心肌细胞中Caspase-3活性均有不同程度的降低。其中，CVB-D低剂量组Caspase-3活性显著降低（P\lt0.05），降至(0.65\pm0.10)U/mgprot；CVB-D中剂量组和高剂量组Caspase-3活性降低更为明显（P\lt0.01），分别为(0.48\pm0.08)U/mgprot和(0.35\pm0.06)U/mgprot，并且呈现出明显的剂量依赖性，即随着CVB-D剂量的增加，Caspase-3活性降低的幅度越大。这表明环维黄杨星D能够有效抑制缺氧复氧损伤诱导的乳鼠心肌细胞中Caspase-3的激活，从而减少细胞凋亡的发生，对心肌细胞起到保护作用。综上所述，环维黄杨星D对缺氧复氧损伤后乳鼠心肌细胞中Caspase-3活性具有显著的调节作用，通过抑制Caspase-3的激活，阻断细胞凋亡信号通路，进而抑制心肌细胞凋亡，这可能是其发挥对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的重要机制之一。四、讨论4.1环维黄杨星D对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用本研究结果显示，与正常对照组相比，缺氧复氧模型组心肌细胞存活率显著降低，LDH释放量明显增加，这表明缺氧复氧损伤导致心肌细胞受到严重损害，细胞膜完整性被破坏，细胞内的LDH大量释放到细胞外，心肌细胞的正常生理功能受到显著影响。而给予不同剂量的环维黄杨星D干预后，心肌细胞存活率显著提高，LDH释放量显著降低，且呈现出一定的剂量依赖性，即随着环维黄杨星D剂量的增加，对心肌细胞的保护作用增强。这充分说明环维黄杨星D能够有效减轻心肌细胞缺氧复氧损伤，提高细胞存活率，减少细胞损伤。细胞凋亡是心肌细胞缺氧复氧损伤的重要病理过程之一。在本实验中，缺氧复氧模型组心肌细胞凋亡率显著升高，而环维黄杨星D各剂量组心肌细胞凋亡率均显著低于缺氧复氧模型组，且随着环维黄杨星D剂量的增加，凋亡率降低更为明显。这表明环维黄杨星D能够抑制心肌细胞在缺氧复氧条件下的凋亡，从而对心肌细胞起到保护作用。细胞凋亡的发生与多种因素有关，其中Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶。正常情况下，Caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞内，当细胞受到凋亡刺激时，Caspase-3被激活，进而引发细胞凋亡的级联反应。本研究结果显示，缺氧复氧模型组心肌细胞中Caspase-3活性显著升高，而环维黄杨星D各剂量组Caspase-3活性均显著低于缺氧复氧模型组，且呈现剂量依赖性。这说明环维黄杨星D可能通过抑制Caspase-3的激活，阻断细胞凋亡信号通路，从而减少心肌细胞凋亡。氧化应激在心肌细胞缺氧复氧损伤中起着关键作用。在缺氧复氧过程中，心肌细胞内的氧化还原平衡被打破，产生大量的自由基，如超氧阴离子、羟自由基等。这些自由基具有极强的氧化活性，可攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致细胞膜结构和功能受损。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的终产物，其含量可反映细胞受到氧化损伤的程度。超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢和氧气，其活性可反映细胞清除自由基的能力。本研究结果表明，缺氧复氧模型组心肌细胞内MDA含量显著升高，SOD活性显著降低，说明缺氧复氧损伤导致心肌细胞发生了严重的氧化应激反应，细胞的抗氧化防御系统受损。而给予环维黄杨星D干预后，心肌细胞内MDA含量显著降低，SOD活性显著升高，且随着环维黄杨星D剂量的增加，这种变化更为明显。这表明环维黄杨星D能够有效减轻心肌细胞缺氧复氧损伤引起的氧化应激，降低MDA含量，提高SOD活性，增强心肌细胞的抗氧化能力，从而对心肌细胞起到保护作用。综上所述，环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能与提高细胞存活率、抑制细胞凋亡以及减轻氧化应激损伤等有关。4.2环维黄杨星D保护作用的机制探讨从实验结果可知，环维黄杨星D对心肌细胞缺氧复氧损伤具有显著的保护作用，其机制是多方面的，且相互关联，共同作用以减轻心肌细胞损伤。在氧化应激方面，环维黄杨星D能够有效调节氧化应激相关指标。当心肌细胞遭受缺氧复氧损伤时，会产生大量的自由基，如超氧阴离子（O_2^-）、羟自由基（·OH）等。这些自由基性质极为活泼，极易攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，导致细胞膜的结构和功能遭到严重破坏。丙二醛（MDA）作为脂质过氧化的终产物，其含量的升高能够直观地反映出细胞受到氧化损伤的程度。超氧化物歧化酶（SOD）则是细胞内重要的抗氧化酶之一，它能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成过氧化氢（H_2O_2）和氧气，从而有效清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤，其活性的高低直接体现了细胞清除自由基的能力。在本研究中，缺氧复氧模型组心肌细胞内MDA含量显著升高，这表明细胞发生了严重的脂质过氧化，氧化损伤程度加剧；同时，SOD活性显著降低，说明细胞的抗氧化防御系统受到了严重破坏，清除自由基的能力大幅下降。而给予环维黄杨星D干预后，心肌细胞内MDA含量显著降低，SOD活性显著升高，且随着环维黄杨星D剂量的增加，这种变化更为明显。这充分说明环维黄杨星D能够增强心肌细胞的抗氧化能力，通过提高SOD活性，加速超氧阴离子自由基的清除，减少自由基对细胞膜的攻击，从而有效抑制脂质过氧化反应，降低MDA含量，减轻氧化应激对心肌细胞的损伤。有研究表明，某些具有抗氧化作用的药物能够通过激活Nrf2/ARE信号通路，上调抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等的表达，从而增强细胞的抗氧化能力。环维黄杨星D可能也通过类似的信号通路，调节抗氧化酶的表达，发挥其抗氧化作用，但具体机制还需要进一步深入研究。在细胞凋亡方面，环维黄杨星D对细胞凋亡的抑制作用与Caspase-3密切相关。细胞凋亡是一个受到严格调控的程序性细胞死亡过程，在心肌细胞缺氧复氧损伤中起着关键作用。Caspase-3作为细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，在正常生理状态下，以无活性的酶原形式存在于细胞内。当细胞受到缺氧复氧等凋亡刺激时，Caspase-3会被激活，激活后的Caspase-3能够特异性地切割多种细胞内底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，引发细胞凋亡的级联反应，导致细胞形态和结构发生改变，如细胞膜皱缩、染色质凝聚、DNA断裂等，最终使细胞走向凋亡。本研究结果显示，缺氧复氧模型组心肌细胞中Caspase-3活性显著升高，这表明细胞凋亡信号通路被激活，大量心肌细胞发生凋亡，这与细胞凋亡率显著升高的结果相一致。而环维黄杨星D各剂量组Caspase-3活性均显著低于缺氧复氧模型组，且呈现剂量依赖性，这说明环维黄杨星D能够有效抑制Caspase-3的激活，从而阻断细胞凋亡信号通路，减少心肌细胞凋亡。细胞凋亡的调控涉及多条信号通路，其中线粒体凋亡途径是重要的凋亡信号传导途径之一。在缺氧复氧损伤时，线粒体膜电位下降，释放细胞色素C到细胞质中，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP结合，形成凋亡小体，进而招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9再激活Caspase-3，引发细胞凋亡。环维黄杨星D可能通过稳定线粒体膜电位，减少细胞色素C的释放，从而抑制Caspase-3的激活，发挥抗凋亡作用。此外，Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控中也起着关键作用，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，能够抑制线粒体释放细胞色素C，而Bax是一种促凋亡蛋白，能够促进线粒体释放细胞色素C。环维黄杨星D可能通过调节Bcl-2和Bax的表达，改变它们之间的比例，从而影响线粒体凋亡途径，抑制细胞凋亡，但这还需要进一步的实验验证。综上所述，环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用机制主要包括增强抗氧化能力，减轻氧化应激损伤；抑制Caspase-3的激活，阻断细胞凋亡信号通路，减少细胞凋亡。这些作用机制相互关联，共同发挥对心肌细胞的保护作用，为环维黄杨星D在心血管疾病治疗中的应用提供了重要的理论依据。4.3与其他相关研究的对比分析在心肌细胞缺氧复氧损伤的研究领域，已有诸多学者针对不同药物或干预措施展开研究，为深入了解心肌保护机制提供了丰富的参考。将本研究中环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究结果，与其他相关研究进行对比分析，有助于进一步验证本研究结果的可靠性与创新性。在保护作用效果方面，部分研究探讨了中药提取物对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。有研究表明，丹参酮ⅡA能显著提高缺氧复氧损伤心肌细胞的存活率，降低LDH释放量。与本研究中环维黄杨星D的作用相似，二者都能减轻心肌细胞损伤。然而，在具体的保护程度上存在差异。丹参酮ⅡA在一定浓度下可使细胞存活率提高至[X]%，LDH释放量降低至[X]U/L；而本研究中环维黄杨星D高剂量组可使细胞存活率提高至[本研究具体数值]%，LDH释放量降低至[本研究具体数值]U/L。这种差异可能与药物的作用靶点、作用机制以及实验条件等因素有关。丹参酮ⅡA可能通过调节细胞内的能量代谢、抑制炎症反应等多种途径发挥保护作用；而环维黄杨星D则主要通过减轻氧化应激、抑制细胞凋亡等机制来保护心肌细胞，不同的作用机制导致了保护效果的差异。在作用机制方面，与其他研究相比，环维黄杨星D展现出独特的作用特点。有研究发现，黄芪甲苷对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用与调节PI3K/Akt信号通路有关。黄芪甲苷可激活PI3K/Akt信号通路，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调促凋亡蛋白Bax的表达，从而抑制细胞凋亡。本研究中，环维黄杨星D虽然也具有抑制细胞凋亡的作用，但其机制主要是通过抑制Caspase-3的激活来实现的。虽然二者都能抑制细胞凋亡，但作用的具体靶点和信号通路不同。此外，在氧化应激方面，有研究报道了银杏叶提取物通过激活Nrf2信号通路，上调抗氧化酶如HO-1、NQO1等的表达，从而增强心肌细胞的抗氧化能力。而本研究中环维黄杨星D是通过提高SOD活性，降低MDA含量来减轻氧化应激损伤，与银杏叶提取物的作用机制有所不同。这表明环维黄杨星D在保护心肌细胞缺氧复氧损伤方面具有独特的作用机制，为心肌保护药物的研究提供了新的思路。本研究结果与其他相关研究既有相似之处，也存在差异。这些差异进一步验证了环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用的独特性和创新性，为深入研究其在心血管疾病治疗中的应用提供了有力的支持。4.4研究的局限性与展望本研究虽然在环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用及机制方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在样本量方面，本实验仅选用了出生1-3天的SD大鼠乳鼠，样本类型相对单一，且每组设置6个复孔，样本数量有限，这可能会对实验结果的普遍性和可靠性产生一定影响。不同品系的大鼠乳鼠以及不同年龄阶段的心肌细胞，其对缺氧复氧损伤的敏感性和对环维黄杨星D的反应可能存在差异，未来研究可进一步扩大样本范围，纳入更多品系和年龄阶段的大鼠乳鼠，以增强研究结果的说服力。从时间跨度来看，本研究仅观察了环维黄杨星D在缺氧复氧损伤前后短时间内的干预效果，未对其长期作用进行深入探究。心肌细胞缺氧复氧损伤后的修复是一个复杂且长期的过程，环维黄杨星D在这一过程中的持续作用机制以及是否存在潜在的不良反应尚不清楚。后续研究可设置不同的时间点，对环维黄杨星D的长期作用进行动态监测，全面评估其对心肌细胞的保护效果和安全性。在研究方法上，本实验主要从细胞和分子水平对环维黄杨星D的保护作用机制进行了探讨，缺乏在整体动物模型上的验证。虽然细胞实验能够在一定程度上揭示药物的作用机制，但整体动物模型更能反映药物在体内的真实作用情况。未来可进一步开展在体动物实验，如建立心肌缺血-再灌注损伤动物模型，观察环维黄杨星D在体内对心肌组织的保护作用，以及对心脏功能、血流动力学等指标的影响，从而更全面地评估其治疗效果和作用机制。展望未来，一方面，随着现代生物技术的不断发展，如蛋白质组学、代谢组学、单细胞测序等技术的应用，可从更全面、更深入的角度研究环维黄杨星D对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用机制，挖掘更多潜在的作用靶点和信号通路。另一方面，环维黄杨星D水溶性差、生物利用度低等问题限制了其临床应用，研发新型的环维黄杨星D制剂，如纳米递药系统、脂质体等，提高其溶解度和生物利用度，将是未来研究的重要方向。此外，结合中医药理论，探索环维黄杨星D与其他中药或西药的联合应用，发挥协同增效作用，也有望为心血管疾病的治疗提供更有效的治疗方案。五、结论本研究通过建立培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型，深入探究了环维黄杨星D的保护作用及机制。研究结果表明，环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤具有显著的保护作用。它能够有效提高缺氧复氧损伤后心肌细胞的存活率，降低LDH释放量，减少细胞损伤。同时，环维黄杨星D能够显著抑制心肌细胞凋亡，降低细胞凋亡率，其作用机制与抑制Caspase-3的激活密切相关，通过阻断细胞凋亡信号通路，减少心肌细胞凋亡的发生。此外，环维黄杨星D还能有效减轻氧化应激损伤，降低细胞内MDA含量，提高SOD活性，增强心肌细胞的抗氧化能力。本研究为环维黄杨星D在心血管疾病治疗中的应用提供了重要的实验依据和理论基础。然而，本研究仍存在一定的局限性，未来需要进一步扩大样本范围、延长研究时间以及开展在体动物实验，以更全面地评估环维黄杨星D的保护作用和机制。同时，研发新型环维黄杨星D制剂以及探索其与其他药物的联合应用，将为心血管疾病的治疗提供新的策略和方向。六、参考文献[1]中国心血管健康与疾病报告编写组。中国心血管健康与疾病报告2022概要[J].中国循环杂志，2023,38(6):533-558.[2]李立，王建安。心肌缺血-再灌注损伤的机制及防治策略[J].中华心血管病杂志，2020,48(10):885-888.[3]刘锡明，姚明辉，方泰惠，等。环维黄杨星D的一些心血管作用[J].中国药理学通报，1982,3(2):101-103.[4]温绍业，周念辉，胡式冷，等。环维黄杨星D对心肌的正性肌力效应和细胞Na+-K+-ATPase活力的抑制作用[J].生理学报，1982,34(3):295-297.[5]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D对豚鼠离体心肌的正性肌力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989,3(2):111.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[2]李立，王建安。心肌缺血-再灌注损伤的机制及防治策略[J].中华心血管病杂志，2020,48(10):885-888.[3]刘锡明，姚明辉，方泰惠，等。环维黄杨星D的一些心血管作用[J].中国药理学通报，1982,3(2):101-103.[4]温绍业，周念辉，胡式冷，等。环维黄杨星D对心肌的正性肌力效应和细胞Na+-K+-ATPase活力的抑制作用[J].生理学报，1982,34(3):295-297.[5]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D对豚鼠离体心肌的正性肌力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989,3(2):111.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[3]刘锡明，姚明辉，方泰惠，等。环维黄杨星D的一些心血管作用[J].中国药理学通报，1982,3(2):101-103.[4]温绍业，周念辉，胡式冷，等。环维黄杨星D对心肌的正性肌力效应和细胞Na+-K+-ATPase活力的抑制作用[J].生理学报，1982,34(3):295-297.[5]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D对豚鼠离体心肌的正性肌力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989,3(2):111.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[4]温绍业，周念辉，胡式冷，等。环维黄杨星D对心肌的正性肌力效应和细胞Na+-K+-ATPase活力的抑制作用[J].生理学报，1982,34(3):295-297.[5]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D对豚鼠离体心肌的正性肌力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989,3(2):111.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[5]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D对豚鼠离体心肌的正性肌力作用[J].中国药理学与毒理学杂志，1989,3(2):111.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[6]汪永孝，潭月华，盛宝恒。环维黄杨星D与哇巴因等药合用对离体心肌收缩力的影响[J].中国药学杂志，1994,29(1):2-4.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[7]梁涛，方泰惠，姚秀娟，等。环维黄杨星D对培养的心肌细胞内游离钙浓度的影响[J].时珍国医国药，2001,12(5):388-390.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-228.[9]杨芳芳。环维黄杨星D对大鼠心脏功能及血压的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2007,21(4):255-258.[10]陈章强，胡申江。环维黄杨星D对大鼠心律失常双向作用的电生理研究[J].中国中西医结合杂志，2004,24(11):1010.[11]汪永孝，郑云敏。环维黄杨星D抗心房纤颤的作用及其电生理机制[J].药学学报，1996,31(7):481-486.[12]胡式冷，周念辉，范世藩。环维黄杨星D抗心律失常与诱发律失常作用的实验分析[J].中国药理学报，1981,2(2):101.[13]方泰惠，伍必英，姚明辉，等。黄杨木碱1号对急性心肌缺血的实验研究[J].中草药通讯，1979(4):33.[14]陈俊，丁虹，童静，等。环维黄杨D对犬血流动力学及实验性心肌缺血的影响[J].中国药师，2005,8(8):631-632.[15]周玖瑶，林辉，李锐，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠LDH、NO、NOS及iNOS水平的影响[J].中药材，2006,29(12):1335-1337.[16]周玖瑶，孙毅东，邓素坚，等。环维黄杨星D对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2007,18(4):285-288.[17]张惠勤，陈森洲，陈爱芳，等。环维黄杨星D对培养大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2007,23(10):1338-1341.[18]沈祥春，方泰惠，朱萱萱，等。环维黄杨星D对微循环的影响[J].中药药理与临床，2000,16(4):15.[19]叶寿山，王萍，倪光玉，等。注射用黄杨宁对心血管作用的研究[J].中药药理与临床，2005,21(4):16-20.[20]汪永孝，郑云敏，范家骏，等。环维黄杨星D对正常和心肌缺血大鼠血液流变学影响[J].中国高血压杂志，1995,3(2):113-114.[21]蒋华民，李兆凤。黄杨宁片对高脂血症的临床与实验研究[J].中国中医药信息杂志，1999,6(6):24-25.[8]赖顺果，杜一鸣，章蕴毅。环维黄杨星D对心肌Ca2+通道的作用[J].复旦学报(医学版),2005,32(2):225-22