第三节载体-基因工程

第三节载体一．载体的概念：1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA二、载体的分类分类依据类别克隆扩增或表达举例1.按功能分成（1）克隆载体（2）表达载体√√PBR322PCDN32.按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体PUC8PBUDCE41YE3.按载体来源分病毒载体＋4.按克隆片段得大小（克隆能力）分(1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√三、基因工程载体的3个特点：（一）能独立自主的复制

载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）能便利的加以检测

如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。

四载体举例介绍1.

质粒载体:

(1)染色体外的双链环状DNA分子(2)大小为1～200kb；(３)能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中可含10～200个拷贝。(4)分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿主范围(5)质粒包含：复制起始区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点常用质粒有：pBR322、pUC19质粒的不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象

（一）大肠杆菌载体Ampr→LacZoriop2.噬菌体载体

什么是噬菌体:噬菌体感染细菌后会出现什么现象烈性噬菌体和温和噬菌体:溶原和溶菌（一）大肠杆菌载体入-噬菌体DNA长度约为48.5kb(分子量3.2×107)在病毒颗粒中为双链线形分子具有12bp的粘性末端(cohesiveend)，进入大肠杆菌之后立即互补成环。Cos位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。

λ-噬菌体结构特点：

1、野生型为48.5kb，两端带有12碱基的单链粘性末端，进入大肠杆菌后环化，既可溶菌又可溶原生长。

2、基因组分为三个区域：左侧区包括使噬菌体成熟的全部基因；中间区不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入此区；右侧区包括所有的主要调控成分。

3、λ-噬菌体基因组中只有60%是溶菌生长必需的，作为克隆载体时，可插入9~23kb的外源DNA片段。（一）大肠杆菌载体λ重组分子的选择主要有下面几种方法。

①cI基因功能选择--cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态。如果在插入型载体的克隆位点上，或是置换型载体的可置换片段中，放上一个cI基因，当外源DNA插入或取代时，便破坏了cI基因，使出现cI-表型。此时，λ重组分子生成的是透亮的噬菌斑，而未重组的λ噬菌体由于仍保有cI基因，所以宿主细菌是溶原化的，就生成混沌的噬菌斑。

②lacZ基因功能选择----lacZ基因的产物为乳糖苷酶，在Xgal—IPTG培养基上显现蓝色。在插入型载体的lacZ基因序列中引入限制性内切核酸酶的切点，外源DNA插入这个克隆位点就会破坏lacZ基因，于是在上述培养基上出现无色的噬菌斑。如果没有同外源DNA形成λ重组分子，则lacZ基因未遭破坏，在培养基上出现蓝色的噬菌斑。

③spi-选择λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能正常生长。

3.柯氏质粒／粘尾质粒(cosmid)定义:含有入噬菌体粘性末端的复合质粒。由入-DNAcos区与质粒重组建造而成.在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。

（一）大肠杆菌载体柯氏质粒特点①含有质粒的抗药性标记如Ampr基因或Tetr基因及自主复制成分，所以这种粘性质粒可以在细菌中大量复制扩增。当体外重组的粘性质粒分子包装成噬菌体颗粒并感染大肠杆菌后，可按质粒的方式进行复制。②带有噬菌体的粘性末端(cos区)。这一粘性末端是体外包装系统必不可少的成分，所以它可以像噬菌体一样进行体外包装。③具有一个或多个限制酶的酶切位点。④其本身分子量小，如pHC79仅6.5kb，可容纳40kb左右的DNA片段。⑤由于非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。大肠杆菌载体

特点：

1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；

2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu+、His+、Ura+、Trpl+等。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；

3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体.

（二）酵母载体酵母载体类型：整合型载体（YIP）复制性载体(YPR)附加体型载体（YEP）整合型载体（YIP）

由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。但酵母片段只提供选择性标志,没有复制起始点.转化率低(只有1-10转化子/微克

DNA)，但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析工作。复制型载体（YRP）复制型载体又称穿梭载体:能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体.

带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。附加体型载体（YEP）由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。YEP型载体PYF92