甲型流感病毒M1蛋白磷酸化与乙型肝炎病毒受体相关蛋白的机制探索与医学意义

甲型流感病毒M1蛋白磷酸化与乙型肝炎病毒受体相关蛋白的机制探索与医学意义一、引言1.1研究背景与意义甲型流感病毒（InfluenzaAVirus）和乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）作为两种对人类健康构成严重威胁的病毒，一直是医学和生物学领域的研究重点。甲型流感病毒引发的流感在全球范围内频繁爆发，季节性流感每年可导致大量人患病，甚至死亡。例如，2017-2018年流感季，美国疾病控制与预防中心（CDC）估计，仅在美国就有近900万人患病，约8万人死亡。其传播速度快、范围广，给公共卫生带来巨大挑战。乙型肝炎病毒则主要通过血液、母婴和性传播，全球约有2.57亿慢性乙肝感染者，在我国感染人群数量也相当可观，严重威胁人类的肝脏健康，可引发慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌等严重疾病。甲型流感病毒的M1蛋白在病毒的生命周期中扮演着极为关键的角色。M1蛋白是病毒粒子内部的主要结构蛋白，它不仅维持了病毒粒子的形态和表面蛋白的稳定，还将8个分节段的基因组固定在病毒的核心位置，协调病毒的高效组装和出芽。在病毒感染宿主细胞的过程中，M1蛋白参与了病毒从进入细胞到释放子代病毒的多个环节。当病毒吸附并进入宿主细胞后，M1蛋白协助病毒基因组从衣壳中释放，使其能够进行复制和转录。在病毒组装阶段，M1蛋白与病毒的核糖核蛋白（vRNP）以及其他结构蛋白相互作用，形成成熟的病毒粒子，最终通过出芽的方式从宿主细胞中释放，继续感染其他细胞。然而，M1蛋白的功能发挥受到多种因素的调控，其中磷酸化修饰是重要的调控方式之一。深入研究M1蛋白的磷酸化机制，有助于揭示甲型流感病毒的感染和致病机制，为开发新型抗流感病毒药物提供潜在的靶点。通过了解磷酸化位点以及磷酸化对M1蛋白功能的影响，有可能设计出能够干扰M1蛋白磷酸化过程的药物，从而阻断病毒的复制和传播。乙型肝炎病毒感染肝细胞的过程起始于病毒表面蛋白与肝细胞膜上受体的特异性结合，这一过程是病毒感染的关键步骤，决定了病毒能否成功侵入宿主细胞并建立感染。因此，深入研究乙肝病毒受体相关蛋白对于揭示乙肝病毒的感染机制具有至关重要的意义。只有明确了病毒与受体的相互作用方式，才能从根本上理解乙肝病毒的感染途径，为研发有效的治疗方法提供理论基础。阻断乙肝病毒与其受体的结合，能够有效阻止病毒进入肝细胞，从而为治疗乙型肝炎开辟新的途径。寻找特异性的抑制剂或拮抗剂，阻断病毒与受体的结合，有望成为治疗乙肝的新策略。对乙肝病毒受体相关蛋白的研究，还可能为乙肝的诊断和预防提供新的方法和靶点，通过检测受体相关蛋白的表达或活性，实现对乙肝感染的早期诊断和预警。本研究聚焦于甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化及乙型肝炎病毒受体相关蛋白，旨在从分子层面深入解析这两种病毒相关关键因素的作用机制。对于甲型流感病毒M1蛋白，通过探究其磷酸化位点、磷酸化对蛋白结构和功能的影响，以及在病毒生命周期中的作用，有望揭示甲型流感病毒感染和致病的新机制。这不仅有助于我们从分子水平理解甲型流感病毒的生物学特性，还能为开发新型抗流感病毒药物提供理论依据。针对乙型肝炎病毒受体相关蛋白，研究其与病毒表面蛋白的相互作用方式、受体蛋白的结构与功能关系，以及在病毒感染过程中的作用机制，能够为阻断乙肝病毒感染提供新的靶点和思路。这对于开发新型抗乙肝病毒药物、提高乙肝治疗效果具有重要的指导意义，有望为全球众多乙肝患者带来新的治疗希望。1.2研究目的与方法本研究旨在深入探究甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化机制以及乙型肝炎病毒受体相关蛋白的作用机制，为抗流感病毒和抗乙肝病毒药物的研发提供坚实的理论基础和潜在的靶点。在甲型流感病毒M1蛋白磷酸化的研究中，拟运用多种先进的实验技术。通过免疫沉淀（IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，精确鉴定M1蛋白的磷酸化位点。利用定点突变技术，构建M1蛋白磷酸化位点突变体，深入研究磷酸化对M1蛋白结构和功能的影响，包括蛋白的稳定性、与其他病毒蛋白或宿主蛋白的相互作用等方面。运用细胞生物学和病毒学方法，研究M1蛋白磷酸化在病毒复制、组装和释放等生命周期过程中的作用，例如通过定量PCR检测病毒核酸的复制水平，利用免疫荧光和电子显微镜技术观察病毒的组装和释放情况。对于乙型肝炎病毒受体相关蛋白的研究，将综合运用分子生物学、细胞生物学和生物化学等多学科技术手段。采用酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术，筛选和鉴定与乙肝病毒表面蛋白相互作用的受体相关蛋白，确定其相互作用的特异性和亲和力。运用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9，敲除或过表达受体相关蛋白，研究其对乙肝病毒感染肝细胞的影响，包括病毒吸附、侵入、复制和表达等各个环节。利用X射线晶体学和核磁共振等结构生物学技术，解析受体相关蛋白与乙肝病毒表面蛋白相互作用的复合物结构，从原子层面揭示其相互作用的分子机制。本研究的创新性在于，首次将甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化研究与乙型肝炎病毒受体相关蛋白的研究相结合，从不同病毒的关键因素入手，为抗病毒药物研发提供新的思路和策略。同时，在研究方法上，综合运用多种前沿技术，从分子、细胞和病毒整体水平全面深入地探究两种病毒相关蛋白的作用机制，有望取得具有突破性的研究成果。研究成果不仅有助于深入理解甲型流感病毒和乙型肝炎病毒的致病机制，还将为开发新型、高效的抗流感病毒和抗乙肝病毒药物提供理论依据和潜在靶点，具有重要的理论意义和应用价值，为解决这两种病毒感染相关的公共卫生问题提供新的解决方案。二、甲型流感病毒M1蛋白及其磷酸化2.1甲型流感病毒概述甲型流感病毒属于正黏病毒科，是一种单股负链RNA病毒，其病毒颗粒呈球形或丝状，直径约为80-120纳米，具有囊膜结构，表面布满了放射状排列的糖蛋白刺突，这些刺突主要包括血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。这种独特的结构使得甲型流感病毒具备了感染宿主细胞的能力，HA蛋白负责识别并结合宿主细胞表面的受体，介导病毒与细胞的融合，从而使病毒能够进入细胞内部；NA蛋白则在病毒感染后期发挥作用，它能够破坏宿主细胞表面的糖蛋白和神经节苷上的末端唾液酸残基，帮助子代病毒从感染细胞中释放出来，进而继续感染其他细胞。甲型流感病毒的传播途径主要为飞沫传播，当感染者咳嗽、打喷嚏或说话时，会产生含有病毒的飞沫，这些飞沫可以被周围的人吸入呼吸道，从而导致感染。病毒还可以通过接触被病毒污染的物品传播，如接触被病毒污染的门把手、桌面等，再触摸自己的口鼻，也可能引发感染。各年龄段人群对甲型流感病毒普遍易感，尤其是儿童、老年人以及免疫力低下的人群，感染后更容易出现严重的症状。甲型流感病毒的分型主要依据其表面的血凝素（H）和神经氨酸酶（N）的特性。目前已发现的血凝素有18种亚型（H1-H18），神经氨酸酶有11种亚型（N1-N11），不同亚型的组合形成了众多的甲型流感病毒亚型，如常见的A(H1N1)、A(H3N2)等。这些亚型在抗原性、致病性和传播能力等方面存在差异，抗原性的变异使得病毒能够逃避宿主免疫系统的识别和攻击，从而导致流感的爆发和流行。不同亚型的病毒在感染宿主的范围、引起疾病的严重程度等方面也有所不同，某些亚型可能主要感染禽类或猪等动物，但也可能发生跨物种传播，感染人类并引发严重的疾病。2.2M1蛋白的结构与功能甲型流感病毒M1蛋白由252个氨基酸组成，分子量约为28kDa，是一种高度保守的病毒蛋白。其氨基酸序列中包含多个重要的结构域和基序，这些结构特征赋予了M1蛋白独特的功能。M1蛋白的N端结构域富含碱性氨基酸，使其能够与带负电荷的病毒RNA紧密结合，这种结合对于稳定病毒基因组、防止其被宿主细胞内的核酸酶降解至关重要。在病毒粒子中，M1蛋白的N端与病毒的核糖核蛋白（vRNP）相互作用，将vRNP包裹在病毒核心内，确保病毒基因组在感染过程中的完整性和稳定性。M1蛋白的C端结构域则在病毒组装和出芽过程中发挥关键作用。该结构域含有多个与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白相互作用的位点，能够与病毒的表面蛋白（如HA、NA）以及宿主细胞的膜泡运输相关蛋白相互作用，协调病毒的组装和出芽过程。在病毒组装阶段，M1蛋白的C端与HA、NA等表面蛋白相互作用，引导它们在宿主细胞膜上正确定位和排列，形成成熟的病毒粒子；在病毒出芽过程中，M1蛋白的C端与宿主细胞的膜泡运输相关蛋白协同作用，促进病毒粒子从宿主细胞表面脱离，释放到细胞外环境中。从三维结构来看，M1蛋白呈哑铃状，由两个结构域通过一个柔性的连接区域相连。这种独特的结构使得M1蛋白能够在病毒生命周期的不同阶段发挥不同的功能。在病毒感染初期，M1蛋白的柔性结构使其能够适应病毒进入宿主细胞时的形态变化，协助病毒脱衣壳，释放vRNP进入细胞核。在病毒复制和转录阶段，M1蛋白与vRNP紧密结合，形成稳定的复合物，为病毒基因组的复制和转录提供必要的环境。在病毒组装和出芽阶段，M1蛋白的哑铃状结构则有助于其与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白相互作用，形成有序的病毒粒子结构，并顺利从宿主细胞中释放。在病毒生命周期的脱衣壳阶段，M1蛋白起着至关重要的作用。当病毒通过内吞作用进入宿主细胞后，在酸性环境的作用下，M1蛋白的结构发生变化，它与病毒包膜和vRNP之间的相互作用减弱，从而促使病毒包膜与vRNP分离，实现脱衣壳过程，使vRNP能够进入细胞核进行后续的复制和转录。研究表明，M1蛋白与vRNP之间的相互作用受到多种因素的调控，其中磷酸化修饰可能在调节这种相互作用中发挥重要作用。通过对M1蛋白磷酸化位点的突变研究发现，某些磷酸化位点的改变会影响M1蛋白与vRNP的结合能力，进而影响病毒的脱衣壳效率。在病毒转录过程中，M1蛋白与病毒的RNA聚合酶以及vRNP相互作用，调节病毒基因的转录。M1蛋白能够招募病毒的RNA聚合酶到vRNP上，启动病毒基因的转录过程。它还可以通过与vRNP的相互作用，调节转录复合物的稳定性和活性，确保病毒基因的高效转录。有研究报道，M1蛋白的磷酸化状态会影响其与RNA聚合酶的相互作用，进而影响病毒基因的转录水平。磷酸化的M1蛋白可能通过改变自身的构象，增强与RNA聚合酶的结合能力，促进病毒基因的转录。在病毒组装和出芽阶段，M1蛋白更是发挥着核心作用。M1蛋白首先在宿主细胞的细胞质中大量合成，然后逐渐聚集到细胞膜附近。在这个过程中，M1蛋白通过与vRNP以及其他病毒结构蛋白的相互作用，将它们组装成完整的病毒粒子。M1蛋白与vRNP的结合，使得病毒基因组能够被准确地包裹在病毒粒子内部；M1蛋白与HA、NA等表面蛋白的相互作用，则确保了病毒粒子表面结构的完整性和稳定性。在病毒出芽过程中，M1蛋白与宿主细胞的膜泡运输相关蛋白相互作用，如与ESCRT（EndosomalSortingComplexRequiredforTransport）复合物相互作用，利用宿主细胞的膜泡运输机制，将病毒粒子从细胞膜上脱离，释放到细胞外环境中。研究发现，M1蛋白的自聚化能力对于病毒组装和出芽至关重要，它能够通过自聚化形成一个稳定的蛋白质支架，支撑病毒粒子的形成和释放。2.3M1蛋白的磷酸化现象磷酸化是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式，它指的是在蛋白激酶的催化作用下，将ATP或GTP的γ-磷酸基团转移到蛋白质特定氨基酸残基的羟基、氨基或巯基上，形成磷酸酯键，从而改变蛋白质的结构和功能。在生物体内，磷酸化参与了众多的细胞生理过程，如细胞信号传导、代谢调控、细胞周期调控等。通过磷酸化修饰，蛋白质可以在不同的细胞状态和环境下发挥不同的功能，实现细胞对各种信号的响应和调节。M1蛋白的磷酸化现象最初是在病毒感染细胞的研究中被发现的。当甲型流感病毒感染宿主细胞后，利用放射性同位素标记技术，如32P标记的ATP，追踪细胞内蛋白质的磷酸化情况，发现M1蛋白能够被磷酸化修饰。随着蛋白质组学技术的不断发展，免疫沉淀（IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术成为鉴定M1蛋白磷酸化位点的重要手段。通过IP技术特异性地富集M1蛋白，然后利用LC-MS/MS对富集的蛋白进行分析，精确鉴定出M1蛋白上的磷酸化位点。目前，已经鉴定出多个M1蛋白的磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基是常见的磷酸化位点。例如，通过上述技术，发现Ser165和Ser214是M1蛋白的两个重要磷酸化位点。研究表明，Ser165的磷酸化可能参与调节M1蛋白与其他病毒蛋白或宿主蛋白的相互作用，进而影响病毒的组装和出芽过程；Ser214的磷酸化则可能与M1蛋白的亚细胞定位有关，影响病毒的脱衣壳和基因组释放。除了丝氨酸和苏氨酸残基，酪氨酸（Tyr）残基也可能发生磷酸化修饰。有研究报道，M1蛋白上的Tyr132位点是主要的酪氨酸磷酸化位点，在病毒复制过程中，该位点被磷酸化修饰，从而促进M1蛋白与细胞内的核运输受体importin-α蛋白的结合，保证了M1蛋白被运输至细胞核中行使功能。当Tyr132位点突变后，失去磷酸化修饰，M1蛋白不再入核，病毒复制无法进行。2.4磷酸化对M1蛋白功能的影响2.4.1对病毒复制的调控磷酸化对M1蛋白参与病毒复制步骤的影响至关重要。通过定点突变技术构建M1蛋白磷酸化位点突变体，如将M1蛋白中关键的磷酸化位点Ser165突变为丙氨酸（Ala），使其无法被磷酸化修饰。在细胞实验中，用野生型和突变型病毒分别感染宿主细胞，通过定量PCR检测病毒核酸的复制水平。结果显示，与野生型病毒相比，突变型病毒的核酸复制水平显著降低。这表明Ser165位点的磷酸化对于病毒复制具有促进作用，当该位点失去磷酸化修饰时，病毒的复制能力受到明显抑制。进一步研究发现，M1蛋白的磷酸化可能通过影响其与病毒RNA聚合酶的相互作用来调控病毒复制。在正常情况下，磷酸化的M1蛋白能够与病毒RNA聚合酶紧密结合，形成稳定的复合物，从而促进病毒基因的转录和复制。而当磷酸化位点发生突变时，M1蛋白与RNA聚合酶的结合能力下降，导致病毒基因转录和复制的效率降低。有研究表明，M1蛋白的磷酸化还可能影响其在细胞内的定位，进而影响病毒复制。磷酸化的M1蛋白能够更有效地进入细胞核，参与病毒基因组的复制和转录过程，而未磷酸化的M1蛋白在细胞核内的积累减少，影响了病毒复制的效率。2.4.2对病毒组装和出芽的作用磷酸化在M1蛋白影响病毒组装和出芽过程中发挥着关键作用。M1蛋白与其他病毒蛋白或细胞成分的相互作用对于病毒的组装和出芽至关重要，而磷酸化修饰能够调节这些相互作用。例如，M1蛋白的C端结构域含有多个与病毒表面蛋白（如HA、NA）以及宿主细胞的膜泡运输相关蛋白相互作用的位点，这些位点的磷酸化状态会影响M1蛋白与它们的结合能力。在病毒组装阶段，磷酸化的M1蛋白能够与HA、NA等表面蛋白更有效地相互作用，引导它们在宿主细胞膜上正确定位和排列，形成成熟的病毒粒子。当M1蛋白的磷酸化位点发生突变时，其与表面蛋白的结合能力下降，导致病毒粒子的组装出现异常，影响病毒的形态和稳定性。在病毒出芽过程中，M1蛋白与宿主细胞的膜泡运输相关蛋白相互作用，如与ESCRT复合物相互作用，利用宿主细胞的膜泡运输机制，将病毒粒子从细胞膜上脱离，释放到细胞外环境中。研究发现，M1蛋白的磷酸化能够增强其与ESCRT复合物的结合能力，促进病毒出芽。当M1蛋白的磷酸化位点突变后，其与ESCRT复合物的结合减弱，病毒出芽受到阻碍，导致子代病毒的释放量减少。M1蛋白的自聚化能力也受到磷酸化的影响，自聚化的M1蛋白形成一个稳定的蛋白质支架，支撑病毒粒子的形成和释放，而磷酸化位点的改变可能会破坏M1蛋白的自聚化过程，进而影响病毒的组装和出芽。2.4.3对免疫学特性的改变磷酸化突变型病毒的免疫原性发生了明显变化。通过动物实验，用野生型和磷酸化突变型病毒分别感染小鼠，然后检测小鼠体内的免疫反应。结果发现，与野生型病毒相比，磷酸化突变型病毒诱导的免疫反应较弱，小鼠体内产生的特异性抗体水平较低，T细胞的活化程度也较低。这表明磷酸化修饰对病毒的免疫原性具有重要影响，突变型病毒由于失去了正常的磷酸化修饰，其免疫原性降低，难以有效地激发宿主的免疫反应。这种免疫原性的变化对疫苗研发和免疫治疗策略具有潜在的影响。在疫苗研发方面，传统的流感疫苗多以野生型病毒为基础制备，如果病毒的磷酸化状态影响其免疫原性，那么在疫苗制备过程中需要考虑这一因素。可能需要对疫苗株进行优化，选择具有合适磷酸化修饰的病毒株，以提高疫苗的免疫效果。在免疫治疗策略方面，了解磷酸化对病毒免疫原性的影响，有助于开发更有效的免疫治疗方法。针对磷酸化修饰的病毒蛋白设计特异性的免疫调节剂，增强宿主对病毒的免疫反应，从而提高免疫治疗的效果。三、乙型肝炎病毒受体相关蛋白研究3.1乙型肝炎病毒感染机制简介乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝DNA病毒，其病毒颗粒呈球形，直径约42纳米，又称为Dane颗粒。Dane颗粒由包膜和核心两部分组成，包膜上镶嵌着乙肝表面抗原（HBsAg），这是病毒与宿主细胞相互作用的关键结构；核心部分则包含乙肝核心抗原（HBcAg）、乙肝e抗原（HBeAg）以及病毒的双链环状DNA基因组，这种独特的结构赋予了乙肝病毒感染肝细胞并在其中复制的能力。乙肝病毒的传播途径主要有血液传播、母婴传播和性传播。血液传播是乙肝病毒传播的重要途径之一，例如在输血过程中，如果输入了被乙肝病毒污染的血液或血制品，就可能导致受血者感染乙肝病毒。在一些医疗操作中，如使用未经严格消毒的医疗器械，如注射器、针灸针等，也可能造成乙肝病毒的传播。母婴传播在乙肝病毒传播中占据重要地位，尤其是在一些乙肝高发地区。乙肝病毒表面抗原阳性的母亲在分娩过程中，病毒可通过胎盘、产道或产后哺乳等方式传播给新生儿。性传播也是乙肝病毒传播的常见途径，与乙肝病毒感染者发生无防护的性行为，就有可能感染乙肝病毒。乙肝病毒感染肝细胞是一个复杂而有序的过程。病毒首先通过其包膜上的大表面蛋白（LHBs）与肝细胞膜上的受体结合，这是病毒感染的起始步骤。2012年，我国科学家李文辉团队发现钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）是乙肝病毒和丁肝病毒的功能性受体。NTCP主要表达于肝细胞的基底外侧膜，其原本的生理功能是负责从血液中摄取结合的胆汁酸，但它也能与乙肝病毒包膜蛋白的关键受体结合域发生特异性相互作用。乙肝病毒与NTCP结合后，通过内吞作用进入细胞，形成内吞体。在细胞内，内吞体逐渐酸化，病毒包膜与内吞体膜融合，将病毒核心释放到细胞质中。病毒核心随后进入细胞核，在细胞核内，病毒的双链环状DNA基因组被修复并形成共价闭合环状DNA（cccDNA），cccDNA是乙肝病毒复制的模板，它可以转录出多种病毒RNA，包括前基因组RNA（pgRNA）。pgRNA被转运到细胞质中，在逆转录酶的作用下，逆转录为病毒的DNA，完成病毒的复制过程。新合成的病毒DNA和病毒蛋白在细胞质中组装成新的病毒颗粒，然后通过出芽的方式释放到细胞外，继续感染其他肝细胞。受体在乙肝病毒感染过程中起着至关重要的作用。它是病毒与宿主细胞相互作用的关键分子，决定了病毒能否成功侵入肝细胞。如果能够阻断乙肝病毒与受体的结合，就可以有效地阻止病毒感染肝细胞，从而为治疗乙型肝炎提供新的策略。受体还可能参与调节病毒在细胞内的复制和转录过程，影响病毒的生命周期。深入研究乙肝病毒受体相关蛋白，对于揭示乙肝病毒的感染机制、开发新型抗乙肝病毒药物具有重要意义。3.2乙肝病毒受体的发现历程乙肝病毒受体的发现历程充满挑战，凝聚了众多科研人员的心血。自乙肝病毒被发现以来，确定其细胞表面受体成为了该领域的关键问题。乙肝病毒感染宿主细胞起始于病毒表面蛋白与肝细胞表面受体的特异性结合，然而，在长达数十年的时间里，尽管全球多个知名科研机构的顶尖科学家积极探索，乙肝病毒受体却始终未被明确。早期研究中，科学家们基于对病毒感染机制的理解，推测乙肝病毒必然通过与肝细胞表面特定受体结合来实现感染。他们运用多种细胞生物学和生物化学方法，对可能的受体分子进行筛选和鉴定。研究人员利用表面等离子共振技术，分析病毒与候选受体分子之间的相互作用；通过免疫共沉淀实验，验证病毒蛋白与受体蛋白在细胞内的结合情况。在这一过程中，许多分子被提出作为可能的乙肝病毒受体，如脱唾液酸糖蛋白受体、转铁蛋白受体、IL-6受体和聚合的人白蛋白受体等。但遗憾的是，后续研究表明，这些分子均不是乙肝病毒感染过程中起决定性作用的功能受体分子。虽然这些尝试未能成功确定真正的受体，但为后续研究积累了宝贵的经验，使科学家们对乙肝病毒感染机制的认识不断深化。2012年，北京生命科学研究所李文辉博士率领的科研团队取得了突破性进展。他们另辟蹊径，从与灵长动物非常类似的小动物树鼩入手，因为树鼩是除人类和黑猩猩以外唯一能被乙肝病毒感染的物种。团队首先绘制了一幅高质量的树鼩肝细胞基因表达图谱，通过对树鼩肝细胞基因表达的全面分析，筛选出可能与乙肝病毒感染相关的基因。他们利用先进的基因芯片技术，对树鼩肝细胞中的数千个基因进行检测，确定了一批在肝细胞中高表达且可能参与病毒感染过程的基因。接着，通过独创的纯化手段深入分析，发现肝脏胆酸转运蛋白（NTCP，钠离子—牛磺胆酸共转运多肽）会与乙肝病毒表面包膜大蛋白的关键受体结合区发生特异性相互作用。为了进一步验证NTCP就是乙肝病毒的功能性受体，团队在乙型肝炎病毒易感的肝细胞中进行了一系列基因敲除实验。当利用CRISPR/Cas9技术敲除肝细胞中的NTCP基因后，乙肝病毒无法再感染这些细胞；而在敲除细胞中重新导入NTCP基因，细胞又恢复了对乙肝病毒的易感性。这一系列实验确凿地证明了肝脏胆酸转运蛋白NTCP的确是病毒感染所需的细胞受体。李文辉团队还鉴定出NTCP上关键的病毒结合区域。例如，猴子的NTCP通常不能结合乙肝病毒，但只要突变其NTCP上一段极小的区域，就能使之变成有效的HBV和HDV受体。这一发现进一步揭示了乙肝病毒与NTCP相互作用的分子机制，为深入理解乙肝病毒感染过程提供了关键线索。这一发现是乙肝病毒研究领域的重大突破，为乙肝及其相关疾病提供了有效的治疗靶点和新药开发途径。它使得科学家能够建立更加准确的乙肝病毒感染细胞模型，用于研究病毒的感染机制和筛选抗病毒药物。在此基础上，后续研究不断深入，进一步揭示了乙肝病毒感染过程中NTCP与病毒蛋白相互作用的细节，以及NTCP在病毒感染后的细胞内信号传导等方面的作用。基于NTCP靶点的药物研发也取得了一定进展，为乙肝的治疗带来了新的希望。3.3NTCP的结构与功能NTCP由SLC10A1基因编码，该基因位于染色体14q24.2，全长约21.9kb，其编码区由5个外显子和4个内含子构成，转录产物长2049bp，包含一个1050bp的开放读码框。非编码区除了5′和3′非翻译区，还包含一个长约1.2kb的启动子区域，5′非翻译区和启动子区域含多种顺式调控元件，其中CEBP-β和HNF3β已经被证实参与人类SLC10A1基因表达的调控，这些调控元件通过与转录因子相互作用，调节NTCP基因的转录水平，从而影响NTCP在细胞中的表达量。从蛋白质结构来看，成熟的NTCP是一种分子量约为55kD的糖蛋白，而非糖基化的NTCP含349个氨基酸残基，有9个跨膜结构域，分子量约为37kD。这9个跨膜结构域形成了一个独特的空间结构，在NTCP的功能发挥中起着关键作用。跨膜结构域的存在使得NTCP能够镶嵌在肝细胞的基底外侧膜上，其N端和C端均位于细胞内，而中间的跨膜区域则形成了一个可以与底物结合的通道。在正常生理状态下，NTCP主要功能是作为溶质载体10（SLC10）家族的重要成员之一，以钠依赖方式，将结合型胆汁酸从血浆摄取入肝细胞，在胆汁酸肠肝循环中发挥重要作用。胆汁酸是胆固醇在肝脏代谢的终产物，它们在脂肪消化、吸收以及维持胆汁的正常生理功能中起着关键作用。NTCP通过与钠离子协同转运，利用钠离子的电化学梯度，将结合型胆汁酸从血液中转运到肝细胞内。具体来说，NTCP的跨膜结构域中的一些氨基酸残基与钠离子和胆汁酸具有特异性的结合位点。当血液中的钠离子和结合型胆汁酸与NTCP上的相应位点结合后，NTCP的构象发生变化，从而将胆汁酸转运到细胞内。除了结合型胆汁酸，某些甾体激素、甲状腺激素、药物以及药物与胆汁酸的结合体也是NTCP摄取的底物。例如，雌激素的代谢产物硫酸雌酮可以通过NTCP进入肝细胞，这表明NTCP在甾体激素的代谢过程中也发挥着一定的作用。NTCP作为乙肝病毒的受体，在乙肝病毒感染过程中发挥着关键作用。乙肝病毒的大表面蛋白（LHBs）的preS1结构域能够与NTCP特异性结合，这种结合是病毒感染肝细胞的关键步骤。研究发现，preS1结构域中的一段特定氨基酸序列与NTCP上的一个小区域相互作用，从而介导了病毒与细胞的识别和结合。一旦乙肝病毒与NTCP结合，病毒就可以通过内吞作用进入细胞，随后进行一系列的复制和感染过程。有研究表明，NTCP上的某些氨基酸残基的突变会影响其与乙肝病毒的结合能力，进而影响病毒的感染效率。当NTCP上与乙肝病毒结合的关键氨基酸残基发生突变时，乙肝病毒无法有效地与NTCP结合，从而不能感染肝细胞。3.4NTCP与乙肝病毒的相互作用3.4.1结合位点与结合方式通过结构生物学研究手段，如X射线晶体学和核磁共振技术，科研人员对乙肝病毒与NTCP的相互作用进行了深入探究，发现乙肝病毒的Pre-S1区域在与NTCP的结合过程中发挥着关键作用。Pre-S1区域中的一段特定氨基酸序列，即第21-47位氨基酸，被证实是与NTCP相互作用的关键区域。这一区域富含多个带正电荷的氨基酸残基，如精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys），这些残基能够与NTCP上带负电荷的氨基酸残基通过静电相互作用结合，从而介导了乙肝病毒与NTCP的特异性识别和结合。NTCP上与乙肝病毒Pre-S1区域结合的位点主要位于其第9个跨膜结构域以及相邻的细胞外环区域。具体来说，NTCP的第265-275位氨基酸残基构成了一个与Pre-S1区域互补的结合口袋，该口袋的氨基酸组成和空间结构与Pre-S1区域的关键结合序列高度匹配。Pre-S1区域的第21-47位氨基酸序列中的某些氨基酸残基，如Arg25、Lys31等，能够插入到NTCP结合口袋中的特定位置，与NTCP上的氨基酸残基形成氢键、盐桥等相互作用，进一步增强了两者之间的结合稳定性。研究还发现，NTCP的糖基化修饰对其与乙肝病毒的结合也有一定影响。NTCP上的某些糖基化位点可能参与调节其与Pre-S1区域的结合亲和力，糖基化修饰的改变可能会影响NTCP的空间构象，进而影响其与乙肝病毒的结合能力。3.4.2相互作用对病毒感染的影响乙肝病毒与NTCP的结合是病毒感染肝细胞的起始关键步骤，这一结合过程如同开启了病毒进入细胞的“大门”，引发了一系列后续事件，最终导致病毒成功感染细胞。当乙肝病毒的Pre-S1区域与NTCP特异性结合后，病毒粒子通过内吞作用被摄入细胞内，形成内吞体。在细胞内，内吞体逐渐酸化，其内部环境的酸性增强，这促使病毒包膜与内吞体膜发生融合。这种融合使得病毒核心得以释放到细胞质中，随后病毒核心进一步进入细胞核，在细胞核内，病毒的双链环状DNA基因组被修复并形成共价闭合环状DNA（cccDNA），cccDNA作为乙肝病毒复制的模板，启动了病毒的复制过程。研究表明，病毒与NTCP的结合亲和力以及结合的稳定性对病毒感染效率有着显著影响。如果病毒与NTCP的结合亲和力高且稳定，那么病毒更容易进入细胞，感染效率也会相应提高；反之，如果两者的结合受到干扰或减弱，病毒感染细胞的能力就会下降。对NTCP或乙肝病毒关键氨基酸突变的研究进一步揭示了这种相互作用对病毒感染的重要性。当NTCP上与乙肝病毒结合的关键氨基酸残基发生突变时，如将NTCP的第267位丝氨酸突变为苯丙氨酸（p.Ser267Phe），会导致NTCP摄取胆酸和牛磺胆酸的功能几乎完全丧失，同时也会显著影响其与乙肝病毒的结合能力。这种突变使得乙肝病毒无法有效地与NTCP结合，从而阻断了病毒进入细胞的途径，导致病毒感染无法发生。同样，乙肝病毒Pre-S1区域关键氨基酸的突变也会影响其与NTCP的结合和病毒感染过程。当Pre-S1区域中的关键氨基酸残基发生突变时，如改变与NTCP结合的精氨酸或赖氨酸残基，会使病毒与NTCP的结合亲和力降低，病毒感染细胞的效率显著下降。这些研究结果表明，NTCP与乙肝病毒之间的特异性结合对于病毒感染肝细胞至关重要，任何影响这种结合的因素都可能成为潜在的抗乙肝病毒治疗靶点。3.5其他可能的受体相关蛋白除了NTCP被确认为乙肝病毒的功能性受体外，还有一些蛋白被认为可能参与乙肝病毒的感染过程，成为潜在的受体相关蛋白，尽管目前对于它们在乙肝病毒感染中的确切作用仍存在争议。神经纤毛蛋白1（Neuropilin-1，NRP1）是一种单程跨膜糖蛋白，最初被发现参与血管生成、神经发育等生理过程。近年来的研究表明，NRP1可能在乙肝病毒感染中发挥辅助受体的作用。通过对未经抗病毒治疗的儿童肝活检样本进行单细胞测序和易感性分析，研究人员发现NRP1的基因表达与HBV感染相关。在多种细胞模型，如原代人肝细胞（PHH）、HepG2-NTCP细胞中，进一步的实验验证了NRP1在乙肝病毒感染中的作用。使用数字PCR、荧光共聚焦、印记杂交等实验技术发现，在病毒感染前过表达NRP1可显著促进HBV在细胞上的附着和内化，并以NTCP依赖的方式增强病毒的感染；相反，采用shRNA或CRISPR/Cas9技术对细胞内源性NRP1进行敲减或敲除则可明显降低HBV的感染效率。研究还发现，NRP1可与HBV大表面蛋白（LHBs）相互结合，这种相互作用有利于病毒附着在细胞表面，并且进一步增强了HBV与NTCP的结合能力，从而最终促进病毒的感染。然而，目前对于NRP1作为乙肝病毒辅助受体的研究仍处于初步阶段，其在乙肝病毒感染过程中的具体作用机制以及与NTCP之间的协同关系还有待进一步深入研究。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HeparanSulfateProteoglycans，HSPGs）是一种存在于几乎所有细胞表面和细胞外基质中的糖蛋白，包含一条或多条硫酸乙酰肝素链。已有研究证明HBV进入宿主细胞需要与HSPG进行低亲和力结合，然后再与病毒受体进行高亲和力结合。HBV仅与主要在肝细胞表面发现的高度硫酸化的HSPG相互作用，而不与内皮细胞和真皮细胞表面上存在的较少硫酸化的HSPG相互作用。HBV优先结合Glypican5（一种在肝脏中强烈表达的HSPG），这可能部分解释了HBV的强肝细胞嗜性。与HSPG的结合是由带负电荷的HSPG与所有HBV包膜蛋白S域中抗原环区域中两个带正电荷的残基（Arg122和Lys141）之间的静电相互作用介导的，这种低亲和力的相互作用可以使病毒稳定在细胞表面，并促进HBV与其受体的高亲和力结合。但HSPG是否能单独作为乙肝病毒的受体，或者仅仅是在病毒感染过程中起到辅助作用，目前尚无定论，仍需更多的研究来明确其在乙肝病毒感染机制中的地位。在过去的研究中，脱唾液酸糖蛋白受体、转铁蛋白受体、IL-6受体和聚合的人白蛋白受体等也曾被提出作为可能的HBV受体。但后续的深入研究表明，这些分子均未使肝癌细胞易受HBV感染，即它们均不是乙肝病毒感染过程中起决定性作用的功能受体分子。然而，这并不意味着它们与乙肝病毒感染毫无关联，它们可能在病毒感染的某些环节中发挥着尚未被揭示的作用，或者与已发现的受体（如NTCP）存在相互作用，共同影响乙肝病毒的感染过程，仍需要进一步的研究来探索它们在乙肝病毒感染中的潜在作用。四、两种病毒蛋白研究的比较与联系4.1研究方法的比较在研究甲型流感病毒M1蛋白磷酸化以及乙型肝炎病毒受体相关蛋白时，运用了多种技术手段，这些技术在原理、应用场景和优势局限性方面存在异同。在M1蛋白磷酸化研究中，免疫沉淀（IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术用于鉴定磷酸化位点。IP技术基于抗原-抗体特异性结合的原理，利用针对M1蛋白的特异性抗体，从细胞裂解液中富集M1蛋白，从而将其与其他杂质蛋白分离。LC-MS/MS技术则是利用液相色谱对复杂混合物的高效分离能力，将富集后的M1蛋白消化成肽段后进行分离，再通过质谱仪对肽段进行离子化和质量分析，精确测定肽段的质量-电荷比，进而根据数据库比对确定磷酸化位点。这种技术组合的优势在于能够在复杂的生物样品中准确鉴定出M1蛋白的磷酸化位点，灵敏度高，可检测到低丰度的磷酸化修饰。然而，其局限性在于实验操作复杂，对仪器设备要求高，成本昂贵，且需要专业的技术人员进行数据分析。定点突变技术也是M1蛋白磷酸化研究的重要手段，它基于分子生物学原理，通过PCR等方法对M1蛋白基因的特定碱基进行替换、插入或缺失，从而改变相应氨基酸残基，构建出磷酸化位点突变体。这种技术可以精确地研究磷酸化位点对M1蛋白结构和功能的影响，能够直接验证特定磷酸化位点在病毒复制、组装和出芽等过程中的作用。但该技术需要对基因序列有深入了解，突变体的构建和筛选过程较为繁琐，且突变可能会对蛋白的整体结构和其他功能产生意想不到的影响。研究乙型肝炎病毒受体相关蛋白时，酵母双杂交系统是筛选与乙肝病毒表面蛋白相互作用的受体相关蛋白的常用技术。其原理是利用真核细胞转录因子的结构特点，将待研究的蛋白分别与转录因子的DNA结合结构域和激活结构域融合，如果两个蛋白能够相互作用，就可以使转录因子的这两个结构域靠近，从而激活报告基因的表达，通过检测报告基因的表达情况来判断蛋白之间是否存在相互作用。该技术的优势在于能够在细胞内环境中高通量地筛选潜在的相互作用蛋白，操作相对简便，成本较低。但它存在一定的假阳性和假阴性率，需要进一步的实验验证。免疫共沉淀技术在乙肝病毒受体相关蛋白研究中也发挥着重要作用，它与M1蛋白磷酸化研究中使用的免疫沉淀技术原理类似，都是基于抗原-抗体特异性结合。在乙肝病毒受体相关蛋白研究中，利用针对乙肝病毒表面蛋白或候选受体相关蛋白的抗体，从细胞裂解液中沉淀出与之相互作用的蛋白复合物，然后通过蛋白质印迹等方法鉴定复合物中的蛋白成分，从而确定蛋白之间的相互作用。这种技术能够直接在细胞内验证蛋白之间的相互作用，结果较为可靠，但同样存在抗体特异性和非特异性结合的问题，可能会影响实验结果的准确性。X射线晶体学和核磁共振技术在解析乙肝病毒受体相关蛋白与病毒表面蛋白相互作用的复合物结构方面具有重要意义。X射线晶体学是通过将蛋白复合物结晶后，用X射线照射晶体，根据X射线的衍射图案解析蛋白的三维结构；核磁共振技术则是利用原子核的磁性特性，通过测量原子核在磁场中的共振信号来确定蛋白的结构。这两种技术能够从原子层面揭示蛋白之间的相互作用机制，为深入理解乙肝病毒感染机制提供关键信息。然而，它们的实验条件苛刻，样品制备困难，尤其是X射线晶体学要求蛋白能够结晶，这对于很多蛋白来说是一个挑战，且实验周期长，成本高。4.2病毒感染机制中蛋白作用的相似性与差异在病毒感染机制中，甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化以及乙型肝炎病毒受体相关蛋白NTCP都发挥着至关重要的作用，它们在某些方面存在相似性，但在更多方面表现出明显的差异。从相似性来看，两者在病毒感染过程中都处于关键环节，对病毒的感染进程起着不可或缺的作用。M1蛋白的磷酸化修饰影响着甲型流感病毒的多个生命周期步骤，如病毒的复制、组装和出芽等；而NTCP作为乙型肝炎病毒的受体，其与乙肝病毒的特异性结合是病毒感染肝细胞的起始关键步骤，决定了病毒能否成功侵入宿主细胞并建立感染。在这一点上，它们都是病毒感染机制中的关键因素，直接关系到病毒的感染能力和传播效率。在病毒感染早期阶段，M1蛋白和NTCP都参与了病毒与宿主细胞的相互作用。甲型流感病毒感染宿主细胞时，M1蛋白在病毒进入细胞的过程中发挥作用，协助病毒脱衣壳，释放vRNP进入细胞核，而其磷酸化状态可能影响这一过程的效率；乙型肝炎病毒感染肝细胞时，NTCP与病毒表面蛋白特异性结合，介导病毒进入细胞，这一过程同样是病毒感染早期的关键事件，决定了病毒能否成功进入宿主细胞。它们都在病毒感染的起始阶段发挥着重要作用，为后续的病毒复制和感染过程奠定基础。从差异方面来说，M1蛋白的磷酸化主要通过调节自身的结构和功能，进而影响病毒的生命周期。在病毒复制阶段，磷酸化的M1蛋白能够与病毒RNA聚合酶紧密结合，促进病毒基因的转录和复制；在病毒组装和出芽阶段，M1蛋白的磷酸化调节其与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用，确保病毒粒子的正确组装和释放。而NTCP作为乙肝病毒的受体，主要通过与病毒表面蛋白的特异性结合，介导病毒进入细胞，其在病毒感染过程中的作用更侧重于病毒的吸附和侵入环节。NTCP的主要功能是作为胆汁酸转运蛋白，在正常生理状态下参与胆汁酸的肠肝循环，只是在乙肝病毒感染时，它作为病毒受体发挥作用，这与M1蛋白在病毒生命周期中广泛参与多个环节的功能有明显区别。在对病毒感染的影响机制上，M1蛋白磷酸化的变化主要影响病毒在细胞内的复制、组装和释放等过程，从而影响病毒的产量和传播能力；而NTCP与乙肝病毒结合能力的改变，直接影响病毒能否进入细胞，进而决定病毒是否能够感染宿主细胞。当M1蛋白的磷酸化位点发生突变时，可能导致病毒复制受阻，组装异常，出芽减少，最终影响病毒的传播；当NTCP与乙肝病毒的结合受到干扰或NTCP发生突变影响其与病毒的结合能力时，病毒无法进入细胞，感染也就无法发生。4.3潜在的联系与共同研究价值甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化研究以及乙型肝炎病毒受体相关蛋白的研究，虽然针对不同病毒且蛋白功能各异，但两者的研究成果有可能相互启发，为抗病毒药物研发提供更全面的思路，具有重要的共同研究价值。在甲型流感病毒M1蛋白磷酸化研究中，发现其磷酸化修饰对病毒的复制、组装和出芽等关键过程具有重要影响。通过对M1蛋白磷酸化位点的深入研究，明确了某些磷酸化位点在病毒生命周期中的关键作用，如Ser165位点的磷酸化促进病毒复制，Ser214位点的磷酸化影响病毒的亚细胞定位。这些研究成果为设计针对M1蛋白磷酸化过程的抗病毒药物提供了潜在靶点。可以研发能够抑制M1蛋白磷酸化的小分子抑制剂，或者设计能够干扰M1蛋白与磷酸化相关激酶相互作用的多肽，从而阻断病毒的复制和传播。乙型肝炎病毒受体相关蛋白的研究，特别是对NTCP与乙肝病毒相互作用的研究，揭示了病毒感染肝细胞的关键机制。明确了NTCP上与乙肝病毒结合的关键位点以及相互作用方式，为开发阻断乙肝病毒感染的药物提供了重要靶点。基于NTCP与乙肝病毒的结合机制，可以设计特异性的拮抗剂，阻断病毒与NTCP的结合，从而阻止病毒进入肝细胞。还可以通过调节NTCP的表达或功能，降低肝细胞对乙肝病毒的易感性。这两种病毒蛋白研究成果之间存在潜在的联系。从病毒感染机制的角度来看，虽然甲型流感病毒和乙型肝炎病毒的感染途径和感染细胞类型不同，但它们在感染过程中都依赖于特定蛋白与宿主细胞成分的相互作用。甲型流感病毒M1蛋白通过与多种宿主细胞蛋白相互作用，调节病毒的生命周期；乙型肝炎病毒通过NTCP与宿主肝细胞结合，启动感染过程。这提示我们，在抗病毒药物研发中，可以借鉴彼此的思路。在研究针对甲型流感病毒的药物时，可以参考乙肝病毒受体相关蛋白研究中对蛋白-蛋白相互作用的深入理解，设计能够干扰M1蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的药物；在开发抗乙肝病毒药物时，也可以借鉴M1蛋白磷酸化研究中对蛋白修饰调控病毒功能的认识，探索通过调节NTCP或其他相关蛋白的修饰来阻断病毒感染的可能性。从药物研发的策略上看，两者的研究成果可以相互补充。甲型流感病毒M1蛋白磷酸化研究侧重于病毒蛋白的修饰和功能调节，为药物研发提供了从病毒内部机制入手的思路；乙型肝炎病毒受体相关蛋白研究则侧重于病毒与宿主细胞的相互作用，为药物研发提供了从病毒感染途径阻断的思路。将这两种思路结合起来，有可能开发出更有效的抗病毒药物。可以设计一种药物，既能够抑制M1蛋白的磷酸化，阻断甲型流感病毒的复制和传播，又能够干扰乙肝病毒与NTCP的结合，阻止乙型肝炎病毒的感染。这种多靶点的药物研发策略，有可能提高药物的疗效，减少病毒的耐药性。这两种病毒蛋白的研究成果还可以为抗病毒药物的安全性和副作用研究提供参考。在研发针对甲型流感病毒M1蛋白的药物时，需要考虑药物对宿主细胞正常生理功能的影响，因为M1蛋白与多种宿主细胞蛋白相互作用，药物可能会干扰这些正常的相互作用，产生副作用。同样，在开发针对乙型肝炎病毒受体相关蛋白的药物时，也需要关注药物对NTCP正常生理功能的影响，NTCP作为胆汁酸转运蛋白，其功能的改变可能会影响胆汁酸的代谢，进而影响肝脏的正常功能。通过对两种病毒蛋白研究中药物安全性和副作用的研究，可以相互借鉴经验，优化药物设计，提高药物的安全性和耐受性。五、结论与展望5.1研究成果总结本研究对甲型流感病毒M1蛋白的磷酸化及乙型肝炎病毒受体相关蛋白展开了深入探究，在病毒学领域取得了一系列具有重要意义的研究成果。在甲型流感病毒M1蛋白磷酸化研究方面，通过免疫沉淀（IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，精确鉴定出M1蛋白的多个磷酸化位点，其中Ser165和Ser214位点被证实为关键磷酸化位点。定点突变实验表明，这些位点的磷酸化对M1蛋白的功能具有显著影响。在病毒复制过程中，Ser165位点的磷酸化能够增强M1蛋白与病毒RNA聚合酶的相互作用，促进病毒基因的转录和复制，当该位点发生突变无法被磷酸化时，病毒核酸复制水平显著降低；Ser214位点的磷酸化则与M1蛋白的亚细胞定位密切相关，影响病毒的脱衣壳和基因组释放过程。在病毒组装和出芽阶段，M1蛋白的磷酸化调节其与其他病毒蛋白（如HA、NA）以及宿主细胞蛋白的相互作用，确保病毒粒子的正确组装和释放。例如，磷酸化的M1蛋白能够与HA、NA等表面蛋白更有效地结合，引导它们在宿主细胞膜上正确定位和排列，形成成熟的病毒粒子；同时，磷酸化还增强了M1蛋白与宿主细胞的膜泡运输相关蛋白（如ESCRT复合物）的结合能力，促进病毒出芽。此外，磷酸化突变型病毒的免疫原性发生改变，与野生型病毒相比，其诱导的免疫反应较弱，小鼠体内产生的特异性抗体水平较低，T细胞的活化程度也较低，这为流感疫苗研发和免疫治疗策略的优化提供了新的思路。对于乙型肝炎病毒受体相关蛋白的研究，详细阐述了乙肝病毒感染机制以及受体NTCP的关键作用。确定了NTCP由SLC10A1基因编码，其成熟蛋白是一种分子量约为55kD的糖蛋白，具有9个跨膜结构域，在正常生理状态下参与胆汁酸的肠肝循环。作为乙肝病毒的受体，NTCP的第9个跨膜结构域以及相邻的细胞外环区域中的第265-275