生物制品学实验指导

生物制品技术实验指导生物工程系信阳农林学院生物与制药工程学院信阳农林学院生物与制药工程学院#微生物实验室目录实验规则⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2实验一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒⋯⋯⋯⋯ 4实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价⋯⋯5实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备⋯⋯⋯⋯ 6实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯9实验八、兔瘟灭活苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11实验十、动物实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15实验十二、免疫血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16实验十二、细菌冷冻真空干燥实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18实验规则实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。必须遵守以下各项。1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。、进实验室不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。8、实验完毕后，须将玻璃仪器、用具等清洗干净，按原来的位置摆设放置，如有破损须报告指导教师，并填写仪器损坏登记簿。关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。10、实验结束后，由值日生负责打扫实验室，保持室内整洁，注意关上水、电、窗、门。实验一猪瘟（HC）、口蹄疫（FMD）抗体间接凝集试验一、目的要求：掌握正向间接凝集反应原理及操作方法。二、原理：将病毒抗原吸附于醛化红细胞上，带抗原的红细胞可以和抗体发生凝集，从而可以检测被检猪的相应抗体水平。三、材料：微量反应板、移液器、滴头、HC诊断抗原、FMD诊断抗原、被检血清、阳性血清、阴性血清各一瓶、生理盐水、微量振荡器、胶布适量。四、方法步骤：1、 用移液器加滴头吸生理盐水。加入微量反应板孔内一排 8孔，每孔加50微升。2、 换一滴头吸一被检血清从第一孔加入50微升，吹吸3次（1：2）吸此孔液体到第2孔，吹吸3次，（1：4），依次类推倍比稀释至第8孔，第8孔再弃去50微升。这样每孔均为50微升，稀释度分别为1：2、1：4⋯⋯1：256。3、 换一滴头吸HC诊断抗原各25微升，分别加入第4孔、第6孔。4、 换一滴头吸FMD诊断抗原各25微升，分别加入第5孔、第7孔。5、 每组做1份对照：在反应板最后一排分别滴阳性血清、阴性血清各2孔，并分别加HC、FMD诊断抗原各25微升。6、 在微量振荡器上振荡2min，室温下（25-30℃）1.5—2h观察。7、 其他同学重复做1—4步。8、 贴胶布、标明被检血清、组别、对照等。9、 结果判断：HC抗体凝集（++）1：16以上为合格；FMD抗体1：128以上为合格。五、思考题：1、 正向间接反应的原理是什么？2、 该试验应注意哪些事项？如何判定自己做的结果准确？3、 当结果出现错误时，有哪些原因造成的？实验二鸡新城疫灭活疫苗的制备——照蛋及接毒一、目的要求：通过试验掌握鸡新城疫灭活油乳疫苗的制备方法。二、原理：新城疫病毒可以在鸡胚中生长、并引起病变和鸡胚死亡。收胚胎尿囊液毒后，可以利用血凝实验测定效价（NDV病毒具有血凝素，可自动凝集红细胞）。符合标准后灭活、加佐剂可制成灭活疫苗。三、材料：孵化10天的受精鸡胚、照蛋器、新城疫II系和IV系疫苗、生理盐水、1ml注射器、石蜡、滴头、注射针头、酒精棉球、镊子。四、方法步骤：1、 将鸡胚先照蛋、画出气室，用酒精棉球消毒接种部位、离气室边缘1cm（避开血管），先用消毒针头钻破蛋壳，然后针头与蛋成30度角进针0.5cm注入0.1mlNDV，1-4组接II系毒种，5-6组接IV系毒种，标记，每2人1个鸡蛋、接种后封蜡。2、 毒种的准备：将疫苗按1羽份0.1ml稀释，然后加入青链霉素溶液，使之达到含500单位青链霉素/ml，接毒时按0.1ml病毒液/枚蛋接种。3、 接毒后的鸡胚放入孵化箱中，37.5℃孵化，24h挑出死胚蛋弃去，其它继续孵化，以后每半天观察1次，挑出死胚，放入4℃冰箱冷藏，到96—120h不论是否死亡都放4℃冰箱冷藏1天。五、思考题：1、 如何确定鸡胚的死活？2、 鸡胚接种有几种方法？日龄是多少？实验三鸡新城疫灭活疫苗的制备——鸡胚收毒及测效价一、 目的要求：掌握新城疫病毒血凝实验操作方法。二、 原理：新城疫病毒有血凝素，可以凝集鸡的红细跑，通过测血凝效价，知道尿囊液中病毒的含量。三、 材料：无菌吸头、脱脂棉、无菌剪子、镊子、无菌烧杯、微量反应板、0.5%鸡红细胞、移液器、滴头、离心机、生理盐水、酒精棉球。四、 方法步骤：1、提前准备0.5%鸡红细胞(鸡的抗凝血加生理盐水离心洗涤 5次，3000转/分、最后配成0.5%红细胞)。2、 将气室用酒精棉球消毒、剪开气室、剪开尿囊膜、用吸头吸尿囊液于烧杯中(可垫少量脱脂棉花，防堵吸头。)3、 测效价：取一微量反应板用移液器吸生理盐水，按第1-12孔各加加50微升。换1个滴头吸被检尿囊液50微升放于第1孔，吹吸3次，再吸此孔50微升到第2孔，依次类推，最后到11孔弃去50微升。稀释度分别为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048。空白12孔生理盐水50微升，做阴性对照。1—12孔各加入0.5%红细胞50微升，阴性对照也加入50微升0.5%红细胞。在微量振荡器上振荡2min，放入湿盒中，25℃、15min后开始观察到60min。判定病毒血凝效价，记录。4、 将尿囊液按每ml加500单位青链霉素，杀菌、4℃保存，同时加入0.1%甲醛灭活，4℃1天。(一般合格弱毒疫苗病毒效价在1：512以上)。5、 尿囊液冰冻保存。留做灭活油乳苗用。五、 思考题：1、 记录你测的血凝效价是多少？是否合格？2、 为什么血凝试验可测鸡新城疫病毒的效价？

实验四鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备四、六、原理：油类是非特异性免疫佐剂，通过一定方法将水剂灭活疫苗和油类乳化在一起，四、六、可提高该疫苗的免疫效果。目的要求：要求学生掌握灭活油乳苗的制备方法。材料：白油、吐温-80、司本-80、硬脂酸铝、新城疫灭活水剂苗、高速捣碎机、量筒、烧杯、离心机、1ml吸管、离心管。方法步骤：1、 预准备：油相：将白油中加入 2%硬脂铝酸、6%司本-80、加热溶化（160-170℃半小时），分装500ml瓶中，116℃灭菌30min，备用，同时灭菌吐温-80。2、 制水相：将水剂疫苗中加入4%吐温-80，高速搅拌2-5min。3、 乳化：将油相加入捣碎机中，缓慢搅拌，慢慢加入水相（ 1：1或1：2，水：油相），然后高速搅拌5min，即成。4、 检查：（1）黏度检查：吸1ml油乳苗放出（垂直）0.4ml为15s，此为适用黏度。（2）稳定性：3000r/min离心15min不分层。作业：1、 记录操作方法和过程。2、 油水能乳化在一起的原理是什么？3、 你做的油乳苗性能是否符合标准？影响因素有那些？实验五氢氧化铝胶和蜂胶的制备一、原理：明矾水和氨水起反应生成铝胶。铝胶是一个比较好的免疫佐剂，具有吸附沉淀、包埋作用、可增强免疫效果。蜂胶的溶解和测定等级二、目的要求：要求学生掌握氢氧化铝胶的制备方法。2KAI（SO4）2?12H2O+HN4OH——2AL（OH）3+K2SO4+3（NH4）+24H2O三、材料：明矾、水桶、电炉、氨水、搅拌器、PH纸、纱布、棉花。四、方法步骤：1、 明矾水的准备：先将明矾砸碎，将水烧至 80℃左右，将明矾按20%加入、搅拌、溶化、澄清10-30分钟、虹吸上清液纱布棉花过滤。2、 合成：将60℃的明矾水搅拌，边搅边加入氨水（缓慢加入） ，当出现浓稠时，PH约8左右，停止加氨水。3、 打碎混匀。将已合成胶放入打碎机中，打磨 2遍。4、 洗去SO42ˉ离子：将胶放入水桶1/4—1/5，补充干净水（纱布棉花过滤）到满桶，每天澄清1次，同时倒去上清水，再补充水，连续4次，以洗去SO42ˉ。5、 将制成胶装500ml瓶，高压灭菌备用。五、示教：磷酸三钙制备先配20%磷酸氢二钠和20%氯化钙灭菌。在灭活菌液100ml中加入2.5ml20%氯化钙，摇匀，然后缓慢加入20%磷酸氢二钠7.5ml，搅拌匀，即成絮状磷酸三钙佐剂疫苗。六、蜂胶制备：1） 酒精融化：一班称50克蜂胶，4度下砸碎，倒入200毫升95%酒精中融化24h。2） 第2天滤纸过滤，渣滓45度烘干，第3天称重，算出蜂胶等级，以及每毫升酒精蜂胶含量。使用，按疫苗每毫升加10mg，摇匀。六、作业：1、 铝胶佐剂有何优缺点？2、 记录铝胶制作过程。3、 你测的蜂胶等级是多少？实验六法氏囊炎病高免卵黄的制备一、目的要求：掌握法氏囊病高免卵黄抗体的制备过程和技术。二、原理：鸡蛋蛋黄中有卵黄抗体，通过人工免疫母鸡法氏囊疫苗多次，卵黄中就有较高的法氏囊炎病毒的抗体，提取该抗体，就可以用于治疗和预防鸡法氏囊炎病。三、材料：法氏囊炎油乳灭活苗、捣碎机、高免鸡蛋、青霉素、链霉素、纱布、 0.1%新洁尔灭、水桶、生理盐水。四、方法步骤：1、 免疫母鸡：提前1个月用法氏囊油乳灭活苗免疫鸡3次，每次1.5ml，10天免疫1次，最后免疫后到10天收蛋，测效价、符合1：128以上即可制法氏囊卵黄抗体。2、 洗高免鸡蛋：将高免鸡蛋置0.3%新洁尔灭溶液中，擦洗消毒、凉干。3、 分离蛋黄：将高免鸡蛋打开两瓣，将蛋清倒入桶中，留下蛋黄备用。4、 制高免蛋黄液：按蛋黄和生理盐水 1：3比例制备，先将8个蛋黄约120ml倒入捣碎机中，开机10秒打匀，停机加入约360ml生理盐水并加各20万青、链霉素，再捣碎开机1-2秒，一层纱布过滤分装于无菌瓶中，即成。零下 5-10℃保存。若有鸡发生法氏囊炎病，按1-2ml/kg肌肉注射该抗体，即可起到治疗和预防作用。五、思考题：1、 制高免卵黄为什么要选用健康母鸡接种？2、 制的高免卵黄为什么要加青、链霉素？实验七法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定一、目的要求：掌握法氏囊炎高免卵黄抗体效价的测定方法。二、原理：法氏囊炎病毒和法氏囊炎卵黄抗体在琼脂凝胶中可以自由扩散，当抗原和抗体相遇时，出现白色沉淀线。以此测定卵黄中的抗体效价。三、材料：法氏囊炎病毒抗原、法氏囊炎卵黄抗体、打孔笔尖、移液器、滴头、微量反应板、酒精灯。四、方法步骤：1、 制琼脂平板：将8%的氯化钠盐水中加入1%含量的琼脂，加热煮沸溶化，加入0.1%石炭酸防腐，等冷至50℃时倒入平皿中，厚3-4mm。2、 打孔：按中心打1孔，周围打6孔，周围孔与中心孔距离4mm。呈6角雪花型，用笔尖头挑出孔中琼脂、最后平皿底在火焰上过几次封底。3、 稀释抗体：（1）用移液器加入微量反应板1-6孔中各50微升生理盐水。（2）换1滴头用移液器吸50微升卵黄抗体，加入第1孔中，吹吸3次（1：2），再在此孔中吸50微升到第2孔中，吹吸3次（1：4），再吸此孔液到第3孔，依次类推，逐步稀释成1：16，1：32、1：64的稀释度。4、 加样：用移液器换1滴头，中心孔加入法氏囊炎抗原，再换1滴头在周围孔分别加1：64、1：32、1：16、1：8、1：4、1：2稀释的抗体。要从高稀释度到低稀释度吸液体、加入，防止拖带现象。每个孔加满为止，不要外溢，一般为15微升。5、 反应：将所做平皿标记、贴标签，放 20℃室温，24-48h内观察沉淀线。6、 判定：中心孔和周围孔出现白色的沉淀线为阳性发应。一般要求制好的卵黄抗体效价达到1：16以上，原液在1：128以上。五、思考题：1、 记录你测的卵黄抗体效价。2、 琼脂扩散的原理是什么？沉淀线什么样的特异的，什么是非特异线？实验八兔瘟灭活苗的制备一、 目的要求：掌握兔瘟灭活疫苗的制备方法。二、 原理：兔瘟病毒高含量存在病死兔的肝脏中，给健康兔接种强毒毒种致死，取肝脏打碎、过滤灭活即成。三、 材料：兔子、注射器、兔瘟毒种、剪子、镊子、解剖刀、捣碎机、移液器、滴头、微量反应板、甲醛、疫苗瓶。四、 方法步骤：1、 接种毒种：用没有免疫过兔瘟的兔子，肌肉注射 5ml毒种，观察体温、症状。特征为突然发病，呼吸困难，出血性败血病变死亡。2、 解剖：病死后，解剖，观察实质脏器是否出血，肺、肾、肝有花斑样外观，淋巴结出血。取肝脏、肾、肺、淋巴结为病料。3、 打浆：按脏器：生理盐水为1：5在组织捣碎机中捣碎，装入三角瓶中，冻融 3次，用4层纱布过滤。4、 测效价：用生理盐水将病毒液在微量反应板上对比稀释 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：128、1：256、1：512、1：1024、1：2048，同时每孔加入等量2%人的红细胞悬液，摇匀，3-5min出现结果，判定血凝效价。决定疫苗最后稀释度，一般血凝效价在1：512以上。5、 灭活：按病料溶液量，按0.4%加入甲醛，37℃灭活24h。若有凝固沉淀，再用纱布过滤一次。6、 无菌检测：将制好的灭活苗接斜面培养基， 37℃培养24h，应无细菌生长。7、 安全试验：将制好的灭活苗肌肉注射 2只健康兔，每只肌肉注射2ml，观察3天，兔子健康，说明疫苗安全。8、 将制好的疫苗无菌分装于20ml疫苗瓶中，封蜡、贴标签、2-15℃保存1年，同时每只兔子均注射1ml，3-4天产生免疫力，免疫期半年以上。五思考题：1、为什么要用没免疫兔子接种强毒？2、记录兔瘟灭活疫苗的制备过程。实验九大肠杆菌自家灭活苗的制备一、目的要求：通过一周实习，使同学们掌握大肠杆菌的分离鉴定及大肠杆菌灭活苗的制备方法和技术。二、原理：大肠杆菌血清型很多，不同猪场血清型不一致，采自家场仔猪黄白痢粪便，分离致病大肠杆菌制成灭活苗，对本场防仔猪黄白痢具有较强的针对性。三、材料：黄白痢病料、伊红美蓝培养基、小白鼠、注射器、牛肉膏、蛋白胨、肉汤培养基、甲醛、接种环、酒精灯、血平板、平皿、试管、兔子、吸管、铝胶、量筒。四、步骤：1、 分离大肠杆菌：用接种环沾仔猪黄白痢粪便划线于伊红美蓝培养基平板上， 37℃培养24h。大肠杆菌为紫黑色金属光泽菌落。2、 检测致病性：（1）挑紫黑色金属光泽菌落接血平板，37℃，24h培养观察有无明显溶血环，有溶血环的为致病性的大肠杆菌。（2）小白鼠致病力试验，将典型的大肠杆菌菌落接种肉汤试管，培养 6-10h，每个菌株接种2只小白鼠，腹腔注射0.2ml，观察3天。在3天内死亡的为致病性大肠杆菌。（3）有条件的情况可检测大肠杆菌的肠毒素及做 K88、K99、P987等抗原的鉴定。3、 制牛肉膏蛋白胨液体培养基，每组做300ml（配方：牛肉膏1.5g，蛋白胨3g，氯化钠1.5g，PH7.6，水300ml）高压灭菌后备用。4、 接种：将检测鉴定的大肠杆菌，由无菌肉汤加入到斜面培养物中，洗脱下菌苔，每个斜面菌接300ml肉汤，标记菌株班、组、日期。接种后 37℃、24h培养。5、 计算菌数：按菌落总数测定方法进行：（1）灭菌：包装的平皿、试管、生理盐水、吸管和营养琼脂。（2）将培养的大肠杆菌液按1：9的比例进行稀释，逐步稀释到10ˉ8。（3）用无菌吸管各吸三个稀释度10--6~--8各1ml，分别加于2个无菌平皿中，并标记，然后将灭菌冷至45-50℃的营养琼脂倾注到加稀释液平皿中，每个约15-20ml培养基，摇匀，37℃，24h培养。（4）按照菌落计数标准，计30-300个菌落数的平皿的实际菌落数，平均2个平皿菌数（以备菌苗最后浓缩的比例，大肠杆菌灭活苗每ml应含菌50亿以上）。6、 灭活：将以培养液按0.25%甲醛的量加入，37℃灭活24h。7、 无菌检查：将灭活的大肠杆菌菌液，用接种环沾一环，接种划线于营养琼脂斜面，37℃24h培养，观察有无菌落生长，无菌生长说明灭活彻底。8、 加佐剂：将已灭活的菌液按20%的量加入氢氧化铝胶，摇匀后，静置24-48h，倾去上清夜，以浓缩，使其达到较高含菌量（按菌数计算来浓缩，一般可以浓缩2-3倍）。9、 安全试验：将已制好的菌苗接种2只兔子，每只注2ml菌苗，观察3天，应健康无病。10、分装：将已灭活浓缩的菌苗，无菌分装于 20ml疫苗瓶中，2-15℃可保存一年。贴上标签，注明疫苗名称、使用方法、保存方法、制造时间。11、使用：母猪产前1个月肌肉注射5ml菌苗，产前15天再注射5ml菌苗。母猪获得免疫，仔猪出生后，通过吃初乳可被动获得免疫。五、思考题：1、大肠杆菌灭活苗为什么自家疫苗效果好？2、大肠杆菌的致病性有哪些方面？3、熟练掌握大肠杆菌自家灭活苗的制作程序。4、鉴定大肠杆菌的生化实验有那些？实验十动物试验一、目的要求：1、掌握常用实验动物保定法和接种法2、掌握实验动物的剖检法及病料中病原微生物的检查二、原理：生物制品的菌种毒力、免疫效果、制剂的安全等，都需要实验动物来完成。三、材料：1ml卡介苗注射器、小白鼠、兔子、生理盐水、炭疽弱毒疫苗、剪刀、镊子、酒精棉球、解剖板，大头针、5%石炭酸消毒液、显微镜、酒精灯、载片、染色液等。四、内容和步骤：（一）、实验动物保定法（教师示教操作）1、小白鼠保定法：右手拿镊子先夹着小鼠尾巴，让其前腿抓着一物体，后退悬空，左手食指和大拇指迅速夹捏紧鼠两耳之间的皮肤，使其头被固定，然后，将鼠背部拉在左手心，无名指和小指压紧尾巴，即固定。2、家兔保定法：可有兔子固定架固定，即兔背躺固定板，固定四脚。另有固定盒子，兔子装入后，卡好，仅露头部。其次是人工手固定，左手食指和拇指把兔子前右腿翻之背部固定，左手中指和无名指把兔子左腿翻转固定于背部，右手抓后两腿拉紧，使兔子背部躺在桌子上，四腿被前后拉紧，兔子呈仰卧，另一助手可进行接种或心脏采血操作。（二）、实验动物人工接种法。（用生理盐水练习）1、练习注射器的使用，用生理盐水，练一个手拿注射器吸生理盐水，会排注射器空气，针头前加酒精棉球，防止有毒液体污染环境。练到得心应手时，可以进行下步操作。2、皮下注射法：小鼠：0、2--0.5ml，针2030°刺入真皮下0、5-1cm，在皮下结缔组织（有鼓包可以看出）。3、腹腔注射法：小鼠：2ml：兔子5ml。将小鼠后部抬高位置，使内脏前移，然后在两后腿之间皮肤往前进针15cm，回针抽有空气，说明是腹腔，然后即可以注射。4、肌肉注射法：（皮下注射剂量），在鼠的后腿肌肉或兔子肌肉进针 0、5—1cm，可注射。（最后一只小白鼠注射0、5ml炭疽疫苗，标记）5、静脉注射法：小白鼠尾静脉，酒精棉球搽或40度热水烫红尾巴，用5号针头，顺血管平行刺入，如果注射看血管血后退，说明正确。兔的耳外侧静脉，指头弹几次耳朵，使之充血，然后用5号针头平行血管进针，如果注射在血管外，会有鼓包。（三）、实验动物解剖尸体—（5%石碳酸）（或75%酒精消毒）—将小白鼠背躺解剖板，四肢拉开大头针固定（灭菌剪刀）—胸腹部真皮剪开—（75%酒精消毒）—腹肌肉消毒—（灭菌剪刀）—打开腹肌和胸肌——观察器官病变、采取病料、抹片、染色、镜检——尸体焚毁或 5%石炭酸浸泡过液。解剖注意观察，皮下、内脏、淋巴结有无出血、坏死、腹腔或胸腔有无积水，找出心脏、肺、肝、脾肾等脏器。然后涂片和染色，显微镜检查或接种合适培养基培养检验。三、思考题：1、 动物实验目的是什么？2、 保定和接种方法有那些？3、 实验动物尸体剖检应在什么条件进行，剖检后可进行哪些检验工作？实验十一、鸡白痢染色平板诊断抗原的制备及使用一、目的：通过本实验，使学生掌握一般凝集实验抗原的制备方法。二、原理：细菌颗粒性抗原经过处理可以作为凝集抗原，用已知抗原可以检测未知抗体，检测传染病或评价抗体水平高低。三、材料：标准鸡白痢菌种，平板培养基，生理盐水，1ml吸管，10ml吸管，L涂抹棒，接种环，酒精灯，甲醛，离心机，甘油，10%酒精溶解的结晶紫，ph7.2PBS，95%酒精，玻片，美蓝染色液，显微镜等。四、步骤和方法：1、 增殖细菌：将约4ml生理盐水，加入斜面标准鸡白痢菌种，接种环反复刮洗，取1ml菌液放于平板内，用L涂抹棒刮匀涂抹接种于营养琼脂平板， 37℃24小时培养（此步骤应该提前1-3天学生进行，为节省时间）。2、 洗脱菌液：已经培养好的平板内，加入 2%甲醛PBS缓冲水5ml，用L棒反复刮洗，倒入小烧杯中，另再加2-3ml涮洗平板，液体也倒入烧杯。3、 洗菌及离心：将菌悬液内加入等量的 95%酒精，作用沉淀半小时，然后离心。4、 配适当浓度菌液：按菌液离心后的体积，按 1：9加1%甲醛PBS，摇匀，接种环一环涂片，直径在0.5-1cm，干燥和固定，美蓝染色2分钟，显微镜检查，达到一个视野50-100个细菌（3亿/ml合格浓度），浓度调整可以加1%PBS调整。5、 染色诊断抗原：菌液加结晶紫酒精溶液（3/10000）和甘油（加入10/100），摇匀，放密闭小瓶保存2-8℃，3年有效。6、 检测使用：摇匀使用，取0.05ml抗原滴于玻璃板上，采成年鸡血或鸡血清0.05ml与抗原混匀，2分钟判定结果，出现50%以上凝集者为阳性，不反应为阴性。阳性种鸡应该淘汰。7、 Ph7.2PBS配置：磷酸氢2钠1.48克,磷酸2氢钾0.43克,氯化钠6.8克,蒸馏水1000毫升,先加热溶解磷酸氢2钠,再加磷酸2氢钾和氯化钠,补足蒸馏水.五、作业及思考题：1、凝集诊断抗原诊断传染病的原理是什么？2、你做的抗原效果怎么样？那些地方需要改进？实验十二、免疫血清的制备一、实验目的和内容目的：学习和掌握免疫血清的制备方法，为凝集反应和沉淀反应准备凝集素和沉淀素。内容：1、抗大肠杆菌血清(凝集素)的制备。2、牛血清白蛋白抗血清(沉淀素)的制备。二、实验材料和用具体重2~3kg的健康雄家兔、大肠杆菌(E.coli)斜面菌种；牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL)、牛肉膏蛋白胨斜面培养基、0.3%甲醛液(用0.85%生理盐水配制)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒干棉球；细菌比浊标准管、无菌吸管、无菌注射器(5mL、20mL)、注射针头(5号，B19)、无菌试管、装有玻璃珠的无菌血清瓶、解剖用具 (解剖台、兔头夹、止血钳、解剖刀、眼科剪刀、镊子、动脉夹等)、双面刀片、丝线、玻璃管、胶管、离心机及无菌离心管、普通冰箱、超净工作台、水浴箱。三、操作步骤(一)凝集素的制备1．凝集原(颗粒性抗原)的制备取37C恒温培养24h的牛肉膏蛋白胨大肠杆菌斜面。每支斜面菌种中加入5mL0.3%甲醛液，小心地把菌苔洗下制成菌液。用无菌清洁吸管，吸取以上菌液，注入装有玻璃珠的无菌血清瓶内，振荡10~25min，分散菌块制成菌悬液。将含菌悬液的血清瓶置于60℃的水浴箱中水浴1h，并不时摇动，把菌杀死。将菌悬液重新接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中， 37℃培养24～48h，如有菌生长，则要在60℃水温中再处理。若无菌生长则进行比浊测定其含菌量。凝集素的制备免疫方法：选择2～3kg健康雄免，从耳缘静脉采血2mL，分离出血清。该血清与准备免疫用的抗原进行凝集反应，以检查有无天然凝集素。如没有或只有极微量时，该动物便可用来免疫。最常用的免疫途径是耳缘静脉注射。将家兔放在家兔固定箱内，一手轻轻拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外侧边缘静脉处消毒，然后用酒精棉球涂擦，并用手指轻轻弹几下静脉血管，使其扩张。消毒细菌悬液瓶塞后，用无菌注射器及5号针头吸取菌液，沿着静脉平行方向刺入静脉血管，并慢慢注入菌液，注射完毕，用干棉球按压住注射处，然后拨出针头，并压迫血管注射处片刻，以防止血液向外溢出。注射时发现注射处隆起，不易推进时，表明针尖不在血管中，应拨出针头，重找位置再注射。有时针尖口被堵塞，菌液推不进去，应及时更换针头。注射途径、剂量和日程安排等视抗原和动物不同而有所不同。大肠杆菌免疫家兔的抗原注射剂量和日程安排如下表：日期第1日第2日第3日第4日第5日注射剂量/mL0.20.40.61.02.0试血：通常于最后一次注射后7~11d，从兔耳缘静脉抽取2mL血，分离析出血清，用试管凝集反应测定抗血清效价。效价合格即可大量采血，如效价不高，可继续注射抗原免疫，提高效价。采血：采血分为心脏采血和颈动脉放血。心脏采血：使免疫家兔仰卧于台上，四肢固定。用左手探明心脏博动最明显处，用碘酒棉球与酒精棉球消毒后，右手握消毒过的20mL注射器和B19号针头，在上述部位的肋骨间隙与胸部呈45°角刺入心脏，微微抽取针筒，此时可发现血液涌入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完毕后，用消毒棉球按压进针处迅速拨出针头，进针处用棉球继续压住。并马上将所采的血液注入无菌大试管内，斜放，待血液凝固后，置于37℃恒温箱中30min，使血清充分析出，然后放入4~6C冰箱中。颈动脉采血：将免疫家兔固定