CN112236512B 具有微流体装置的分析系统、微流体装置和相关方法 （北卡罗来纳-查佩尔山大学）

2020.11.30PCT/US2019/0597732019.11.05WO2020/162996EN2020.08.13US2006040297A1,2006.02.23US2016253584A1,2016.09.01与所述至少一个微流体装置光学连通的所述外联到所述光学系统并且热偶联到保持在所述外模块配置成选择所述微流体装置的至少一个流2至少一个微流体装置包含多个流体通道，每个流体通道具有沿光学系统，其偶联到与所述至少一个微流体装置光学连通的所述热源，其偶联到所述光学系统并且热偶联到保持在所述包含计算机程序代码的子阵列选择模块，其与所述整合在所述控制器中和/或偶联到所述控制器的信号分析模块，其中将所述信号分析模块配置成获得所述多组微孔的所选的子阵列中的每一个微孔的模拟PCR信号，并且其中微孔的一部分或全部的一个或多个数字PC2.权利要求1所述的系统，所述系统进一步包含保持在与所述至少一个微流体装置相3.权利要求1或2所述的系统，其中所述多4.权利要求1或2所述的系统，其中在光激发之5.权利要求1或2所述的系统，其中所述子阵6.权利要求1或2所述的系统，其中所述子阵列7.权利要求1或2所述的系统，其中所述光学系统包含至少第一滤波器和/或第二滤波器，所述至少第一滤波器和/或第二滤波器限定对应于第一目标编码的珠和第二目标编码的珠的第一波长和/或第二波长的激发光，用于解码保持在所述微流体装置的至少一个流8.权利要求1或2所述的系统，其中当振幅随对于所3等于或大于1个分子/微孔，并且其中所述模拟PCR信号限定阈值循环或循环阈值Ct和目标10.权利要求1或2所述的系统，其中在所述测定的多个不同的反应步骤的每隔一个或和/或其中在所述测定的多个不同的反应步骤的每隔一个或每一个之后，针对一行中的多所述光学系统以确定提供给所述多个流体通道中的一个或多个的原始样品中的目标物质15.权利要求14所述的系统，其中所述保持器包含在相邻的微流体装置之间提供热障4[0002]本申请要求于2018年11月13日提交的美国临时专利申请序号62/760,604和于2019年3月28日提交的美国临时专利申请序号62/825,523的益处和优先权，其内容通过引[0004]本发明在美国国防部(DARPA)授予的许可号HR0011-12-2-0001下由政府支持下进[0006]ASCII文本格式的序列表，在37C.F.R.§1.821下提交，标题为5470-860WO_[0008]本专利文件的公开内容的一部分含有受版权保护的材料。版权所有人，The适于从编码的珠微孔阵列获得聚合酶链反应[0010]聚合酶链反应(PCR)是一种用于扩增基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)的片段的基于嵌入染料荧光的检测仅能够确定总dsDNA浓度，并因此使用该检测方法不可能在单个至少六种染料的多重化，但是通过该方法的多重化最终受限于仪器和染料之间的光谱重5[0012]本发明的实施方案提供PCR主混合物和磁性颗粒化学物质的制剂，其特别适用于[0015]所述系统可以包括保持在与至少一个微流体装置相邻的所述外壳中的至少一个磁体。所述磁体可以配置成在珠的负载操作期间沿至少一个流体通道平移以磁性偶联到与来自所述多个流体通道的每个流体通道的对准的微孔的一个子组[0018]所述子阵列选择模块可以在所述测定的不同的反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)选择所述微流体装置的所述微孔组的不同的子组，并引导所述光学系统仅激发续或并行获取所述当前选择的子组中的所述微孔组的不同[0019]所述子阵列选择模块可以在所述测定的至少一些不同的连续反应步骤(例如，所述测定的不同的热循环)选择微孔的相同的子组，并引导所述光学系统将光仅传输到所述在3-100个之间)，所述至少第一滤波器和/或第二滤波器限定对应于第一目标编码的珠和第二目标编码的珠的相应第一波长和/或第二波长的激发光，用于解码保持在所述微流体[0021]所述系统可以具有整合在所述控制器中和/或偶联到所述控制器的信号分析模信号确定与所限定的珠类型相关联的反应的目标分6[0022]所述信号分析模块可以进一步配置成获得所述微孔组的一个或多个数字PCR信[0023]当振幅随对于所述流体通道的所述一组或多组微孔中的输入材料的PCR循环数变1个分子/微孔。所述模拟信号可以限定阈值循环或循环阈值Ct和目标物质和/或分子类型通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同的[0026]所述光学系统可以具有含有视场(FOV)的相机，所述视场仅覆盖所述微流体装置[0027]在一些特定实施方案中，所限定的FOV可以任选地覆盖在2-10个之间或更多个相邻的流体通道和/或所述微流体装置的流体通道总[0028]所述控制器和/或所述信号分析模块可以配置成引导所述光学系统获得PCR前和流体通道的原始样品中的目标物质的一个或多个浓度和/或一个或多个分[0034]所述染料均匀剂可以存在于所述微流体装置中存在的主混合物中和/或所述染料体通道定位的多组微孔；仅从所述多组微孔的所限定的子组获得信号强度数据(任选地响或目标分子相关联的目标物质和/或分子类型呈阳性7[0037]所述方法可以包括在测定的多个连续反应步骤中的每一个之后(例如，在所述测定的多个连续热循环中的每一个之后)，将所述多组微孔的所限定的子组变为不同的所限[0038]经测定的多个连续反应步骤(例如，在所述测定的多个连续热循环的每一个之[0039]所述流体分析装置可以包括具有相应微孔(任选地，在2-100之间)的多个流体通[0042]可以进行所述激发和获得以在测定的多个连续反应步骤(例如热循环)中的每一[0043]通过连续地或并行地获得微孔组的所限定的子组的不同的流体通道中的不同的所限定的邻近微孔组的图像，可以使用具有视场(FOV)的相机进行仅从所限定的子组获得[0044]所述微孔组中的每一个可以具有在1,000-1,000,000个范围内的微孔的微孔阵[0046]所述方法可以包括在所述传输和获得步骤之前电子鉴定位于所述微流体装置中8体通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同[0052]通过使用具有视场(FOV)的相机可以获得所获得的信号强度，所述视场仅覆盖所并且作为所述微流体装置的相应流体通道的其它微孔组的微孔中的类似反应的实时PCR曲线的估计值提供，从而即使在不同的反应步骤之后不是每个流体通道的所有微孔组都成9[0057]所述流体分析装置(任选地所述第一流体通道和/或所述多组微孔)可以包括染料[0058]所述染料均匀剂可以存在于所述流体分析装置中存在的主混合物中(例如，存在于所述第一流体通道和/或所述多组微孔中)和/或所述染料均匀剂可以附着于所述流体分长度维度的所述直的或弓形的长度片段定位[0061]所述多个流体通道中的至少一些在所述直的或弓形的长度片段上可以是基本上[0064]所述多个流体通道可以具有第一组流体通道和与所述第一组间隔开的第二组流[0066]所述多个流体通道可以包括限定第一邻近组的至少两个流体通道和限定与所述[0067]所述装置可以包括在所述第一邻近组和所述第二邻近组的第一流体通道和第二道中的每一个的所述多组微孔可以在行和/或列中彼此对准。所述多个流体通道可以保持[0069]用于相应流体通道的至少多组所述微孔可以各自包含具有在1,000-1,000,000范而允许在所述微流体装置中1,000-1,00[0071]所述多个流体通道的每个流体通道可以具有在第一端处的单独的第一端口作为向位置在所述长度维度上与所述第一纵向位置[0075]具有所述弓形的长度片段的流体通道的同心组可以作为多个周向间隔开的流体[0079]所述染料均匀剂可以存在于所述微流体装置中存在的主混合物中和/或所述染料[0080]其它实施方案涉及珠负载策略和如所示和/或所述的隔离的珠输入和共同的试剂征可以以任何方式和/或组合来组合。申请人保留改变任何最初提交的权利要求或相应地提交任何新权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以从属于和/或并入其它目标和/或方面将在下面阐述的说明书中[0090]图3B是根据本发明的实施方案取自在图3A中所示的流体装置的一部分的几个微孔的不同的子组的实时PCR数据获得的原始[0096]图7A-7H是根据本发明的实施方案的从不同的流体通道中的一行珠孔组收集的实[0098]图9-16是根据本发明的实施方案的具有不同的流体通道的配置的不同的实例装[0102]图20A-20D是根据本发明的实施方案的使用磁体的微芯片的实例负载操作的放大片用含有20XSYBR加上5μM不可[0105]图23是12重呼吸面板测定内支原体的平均分子/珠(数字阳性信号)的图(尽管与通道中的5阵列之一的结果，其中每个阵列负载有来自根据本发明的实施方案的相同样品[0108]现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，在附图中显示本发明的实施方件或特征的厚度可能被夸大。在文本和附图中，可以互换地使用单词“图”的缩写“图述的材料或步骤“和本质上不影响所要求保护的发明的一个或多个基本和新颖特性的那等来描述如在附图中说明的一个元件或特征与另外的一个或多个元件或一个或多个特征的关系。应理解，空间相对术语旨在包括除了图中描述的取向之外的装置在使用或操作中则操作(或步骤)的顺序不局限于在权利要求或附图阵列120a(珠微孔阵列)(图3B)和/或不火和通过聚合酶延伸引物的一整套步骤。参见Arya等人,Exp[0123]在一些实施方案中，本文所述的设计和方法可以减少大阵列(例如，编码的珠阵文所述的方法可以适用于其中在各个时间点收集变化信号设计、固体支撑物(例如，编码的固体支撑物)、步骤和/或方法：标题为"Compositions,Devices,andMethodsforImprovingaSurfacePropertyofaSubstrate"的美国临时申请号62/673,343、标题为"Compounds,Compositions,andMethodsforImprovingPCT/US2016/043463和/或国际申请号PCT/US2016/055407中所述的，各自的内容通过引用[0125]在一些实施方案中，本发明的方法包括使用珠(例如超顺磁珠)将试剂和/或目标递送到反应孔中的方法，例如在美国申请公开号2015/0211048和国际申请号PCT/US2016/流体芯片的直径或宽度维度可以是约2.13英寸(54mm)和/或直径或长度维度为约3.4英寸[0135]如在图1A和图2中所示，至少一个细长的流体通道15包含八个相邻的流体通道和158[0137]沿相应流体通道15的相邻的微孔20的组(微孔组)之间的间隙空间21不需要由连续微孔20中的物理间隙或裂口提供，而是可以由成像系统的视场和/或辐射源的照明窗口[0139]再次参考图1A和图2，用于流体通道15的多组微孔20可以在对准的基本并行的行五个或甚至更多个相邻的通道(包括整行)可以限定端口)可以包含具有穿过覆盖基材10u的通孔16v的储器16r，以将输入材料从储器16r引导口16更少数量的第二端口18，因为一些或所有的流体通道15可以经由歧管18m或直接从流流体通道15的组可以与相应不同的第二端口18(主混合物/油端口)流体连通(图16)。如下从通过流体通道15的相应纵向延伸中心绘制的相邻的中心线C/L稍微成角度地变化10％或[0145]参考图3A-3C，每组或一些微孔20的组(微孔组)可以包含具有珠保留片段120w和并行于和/或与流体装置10的顶部或覆盖基材10u(图2A)的主表面成直线。测定信号片段120s与相应微孔120的珠保留片段120w流体连通。测定信号片段120s可以产生窄尾测定信段120s流体连接，使得从保持在珠保留片段120w中的珠释放的试剂和/或分析物可以扩散4[0147]流体通道15的每个阵列10a可以具有单个共同的第二端口18，用于引入负载缓冲[0150]图16说明流体通道15可以是弓形的流体通道15a，并且围绕圆形几何布置的直径管18m的至少一个内腿18i朝向第二端口径向延伸，并且相应阵列AR的中心线C/L朝向第二[0152]图12-15显示流体通道15配置为径向向内延伸通道15r。通道15r从流体装置10的种情况下，同时(共同)成像的微孔20的组可以与其它配置(不是并行的矩形等)不同地布[0153]阵列10a(微芯片阵列)可以限定对应于位置地址(例如行和列地址)的每个流体通[0155]每个流体通道15中的微孔20的相应组可以对准以具有相同的纵向和横向伸展和15中的相邻的且至少部分横向对准的微孔[0156]相应流体通道15的一些组或每组微孔20的微孔120(图3A)可以作为具有在1,000-[0159]在一些实施方案中，流体装置10(微芯片)可以配置成在微孔120中用多于一个珠[0160]用于相应流体通道15的不同组的微孔20可以具有相同或不同数量的微孔120(图测器220(图8)(例如至少一个相机)在任何一个时间点使微孔20的组的不同的子组10s(例如被FOV25覆盖的多个不同的流体通道15(样品通道)的单个微孔阵列120a)成像。邻近组的激发光传输至流体装置10的微孔20的组的阵列10a(整个阵列)的所限定的子阵列10s(图的样品通道的至少一组微孔20，但小于流体装置10(微芯片)的所有微孔20的组(微孔组)。[0163]如在图1A中所示，所限定的子阵列10s可以与流体装置10的微孔的阵列10a(整个分析，通常通过在第一测定循环之后在单个位置使流体通道15的相应邻近通道15n中的微[0167]材料输入可以包含样品或样品的分析物，并且可以包括[0169]探针和引物(包括用于扩增和/或检测的那些)是任何合适长度的寡核苷酸(包括合物中加入嵌入染料并监测荧光信号强度来检测扩增的序列，所述荧光信号强度与双链条件下不那么强地结合不含有感兴趣的多态性的DNA，并且其可以在扩增反应中用作用于[0174]通常，用于检测含有感兴趣的多态性或突变的DNA的寡核苷酸探针是在相同的杂[0175]本发明的实施方案可以用于紧凑阵列中的单重反应(SiRCA)，这是用于灵敏的高浓度下，作为来自相同反应类型的所有孔的荧光信号的平均值测量的实时PCR(模拟信号)(图3B)，其直径为珠直径的约100％-约150深度为珠直径的约50％-约185并且具有由测定信号片段120s(窄的口袋或狭缝)(图3B)或标准珠不能物理地配合到其中的其它几[0178]使用具有微管格式的珠和/或流体装置10(芯片)上的微孔阵列120a可以进行NA-拷贝/μL至10,000,000拷贝/μL的整个范围内观察到优异的线性。在低浓度(50-150拷贝/μ度。假设PCR反应中扩增效率为100则来自目标样品的Ct(CtS)可以与具有已知初始浓度[0184]本发明的微流体装置可以任选地以高通量应用和/或方式提供一个或多个(例如，地在单个阵列10a或多个阵列10a(后者在图9-11和图16中显示)中提供的两个或更多个流在一些实施方案中，流体装置10(微流体装置)的一个或多个阵列10a中的多个流体通道15[0186]定制光学装置的替代方案是使用精确定位台来水平、竖直和/或旋转地移动相机法允许以增加的测定时间为代价使许多阵列成像。对于具有提供30,000-40,000或更多个利用根据本发明的实施方案的编码的微孔阵列120a[0188]编码的珠阵列的性质可以允许模拟PCR数据收集和分析的独特方法。如果目标分[0189]该方法的一种实现方式可以通过使用在图1A中所示的流体装置10布局的以下实流体通道15(任选地具有两个或更多个不同的样品)的相应微孔120(图3B)的微孔20的组的阵列10s的子组可以由相机在单个框中成像(相机的视场由图1A、图1B中的1A、2A处的框盒集模拟数据而不使不同组的微孔20的整个阵列10a成像。[0190]图17是说明鉴定目标物质和/或目标分子的实例方法的流程图。提供具有第一流体通道的流体分析装置，所述第一流体通道具有沿第一流体通道间隔开的多组微孔(框测定的多个连续热循环中的每一个之后)，将多组微孔的所限定的子组变为不同的所限定场仅覆盖相应流体通道15(样品通道)中的微孔20的组的子组以及仅覆盖一个或多个邻近行。流体装置10用负载缓冲液润湿并定位在偶联到或与线性磁体或磁体800的阵列协作的保持器900(图21)上(框700)。输入端口16的通孔16v可以任选地在两个邻近的相邻的行中在每组微孔20(阵列)下方沿流体通道15朝向歧管通道和/或第二端口18(主混合端口)滑力下泵送密封油，直到密封油密封微孔20的组并从流体通道15中置换过量的主混合物(框中置换时收集水性溶液，或者可以使用部分真空在液体从通孔16v和/或储器16r渗出时去组，都可以通过蜡或石蜡阀或疏水收缩部以防止其在主混合物加入和/或密封步骤之前填度下使阵列10a成像，以确定在PCR循环之后检测的扩增子的熔点和/或范围。将滤波器组(F12自阵列10a中的微孔20的每个组的信号具有五个循环的分辨率(因为每五个PCR循环，每个的焦点和/或装置的不同水平的硅烷化的影响。如果通过将PCR图像信号除以PCR前图像信[0219]在PCR期间未成像的微孔20的组将具有非常少的光漂白，而成像的子阵列可能显自几百个珠的平均信号应该足以准确和精确[0222]跨多个子阵列收集模拟数据(例如，如关于实例方法1所描述的)的优点可以包括度的光漂白可以允许在比所有30个循环成像所需的那些更低嵌入染料(例如SYBRGreen图像可以用于确定哪一行具有用于模拟实时PCR分析的最佳珠负载。这可以帮助改善如果一个或几个子阵列没有负载足够的珠用于模拟分析可能发生的问题(尽管该问题可以通过[0225]所示的流体装置10仅是设计概念的示范(即，将珠/反应孔阵列分成一系列子阵微流体回路和/或进行测定所需的标记或扩增试[0227]聚苯乙烯珠可以从水性溶液中吸收疏水性分子以及带电分子。微孔120(微孔阵荧光的变化(CV0.7％)。由于SYBR吸收(并因此PCR反应中SYBR的浓度)的变化可以修改目标扩增和荧光信号，阵列之间的SYBR吸收的变化导致阳性反应数量(即，数字PCR信号)变的浓度。另外，控制跨整个阵列的嵌入染料浓度可以潜在地导致dsDNA熔融温度的较小变染料荧光通道中观察到的荧光信号的位移(CV14％)。当在溶液中加入不可延伸的寡聚物(pdsDNA)，其任选地通过可以从IDT获得的生物素-TEG连接化学连接到珠，因为dsDNA比(除了引物和嵌入染料以外)和任选地包括染料均匀剂的主混合物引入微孔阵列的通道中，[0232]图25显示得自IDT的5'生物素TEG连接(顶部)。显示部分双链DNA引物的实例(底素官能团的接头(例如，碳链，任选地C1-C20烃)可以被修饰以调节其疏水性和/或离子电网格900g的外周910，并且可以在相邻的流体装置10的侧面和端之间限定横向绝热阻挡区域920和纵向绝热阻挡区域930。第二端口18(主混合物端口)可以跨阻挡片段(纵向绝热阻(微阵列芯片)的热循环和/或成像可以由系统200(测试系统)同步，使得每个流体装置10[0235]在一些实施方案中，本发明的流体装置10可以由是绝热体的基材(例如塑料)制[0236]本发明的流体装置10可以与市售可得的自动化的样品制备(例如移液机器人和/[0237]可以使用的光学系统(光学信号检测器220)(图8)包括但不局限于双光或多光成凑阵列(SiRCA)中单重反应中光漂白对测定信号的影响。本发明的流体装置10可以包含两装置10(阵列)可以使用微孔20的组的子组成像。不同组的微孔20的子组可以按顺序成像，环分辨率确定每个反应类型的循环阈值，而不需要在每个PCR循环之后使整个阵列成像的号，但是每行/片段(并因此每个反应)将仅接收1/5剂量的用于记录荧光数据的激发能量。[0241]在一些实施方案中，本发明的装置可以用于代替任何多重化的PCR或免疫测定面学信号检测器220)包括电子信号检测器222，例如包含相机或其它成像装置或其它信号检[0243]光学系统(光学信号检测器220)可以任选地包括激发源22置10的阵列10a(微孔阵列)的信号和/或图像子组或子阵列10s(任选地响应于引导光学系[0244]系统200还可以包括信号分析模块260。信号分析模块260可以分析来自不同组的者当荧光信号没有上升到阈值以上时，将目标物质和/或分子类型的PCR反应鉴定为阴性。[0246]控制器210可以与配置成在不同的测定循环期间选择不同组的微孔的子阵列选择模块250(即，包含计算机程序代码)连通。模块(子阵列选择模块250和/或信号分析模块260)可以全部或部分地在控制器和/或光学系统(光学信号检测器220)上或远离所述控制选择或除此之外，在流体装置10的一个或多个位置处的对准标记27(图1)可以用于该位置[0248]模块(子阵列选择模块250或信号分析模块260)可以在系统200(分析系统)上或分服务器300还可以经由有线或无线连接与网络连通，并且可以包括各种类型的有形非暂时[0250]控制器210可以经由收发器214和/或计算机网络或蜂窝网络与服务器410或计算AIX和zOS是InternationalBusinessMachinesCorporation在美国、其它国家或两者中的商标，而Linux是LinusTorvalds在美国、其它国家或两者中的商标。Microsoft和器558通常包括由应用程序554通过操作系统552访问的软件例程，以与装置(例如输入/输输出装置驱动器558和可以位于存储器536中的其它软件程序使用的静态和[0254]数据556可以包括(存档或存储的)数字图像数据集522。如在图18中进一步说明的，根据本发明的一些实施方案，应用程序554包括微孔子组选择模块(子阵列选择模块250)和信号分析模块260。应用程序554可以位于本地服务器(或处理器)和/或数据库或远[0255]尽管参考图18中的应用程序554以及模块(子阵列选择模块250和信号分析模块这些回路和模块也可以被并入操作系统552或数据处理系统的其它这样的逻辑划分中，而不是作为应用程序554。此外，虽然应用程序或模块(子阵列选择模块250、信号分析模块限于在图18中说明的配置，而是可以由数据处理系统之间的功能的其它布置和/或划分来[0256]为了开发方便，可以用高级编程语言(Python、Java、AJAX(Asynchronous(ASIC)或编程的数字信号处理器或微控制器来实现。程序代码可以完全在一个(例如工作和/或框图中的框的组合可以由计算机程序指令实现。可以将这些计算机程序指令提供给机或其它可编程数据处理设备的处理器执行的指令创建用于实现流程图和/或框图的一个实现流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/它可编程设备上执行的指令提供用于实现流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功[0260]本文的某些附图的流程图和框图说明本发明的实施方案的可能实现的示例性架参考文献都通过引用以其整体并入本文，用于与其中呈现参考文献的句子和/或段落相关