CN112384787B 确定多个非内源性光谱贡献者的丰度的方法和存储介质 （阿科亚生物科学股份有限公司）

2020.12.31PCT/US2019/03073520WO2019/213618EN2019.11.07US2016011116A1,2016确定多个非内源性光谱贡献者的丰度的方将生物样本暴露于照射光并测量来自样本的光像对应于照射光的波长带和光发射的一个或多暴露于背景激发带中的照射光并测量背景光谱带中的来自样本的光发射以获得样本的背景图像(106)，其中背景光谱带对应于波长范围内的2将生物样本中的多个非内源性光谱贡献者暴露于照射光并测量来自样本的光发射以获得N个样本图像，其中每个样本图像对应于所述照射光的波长带和所述光发射的一个或将样本暴露于背景激发带中的照射光并测量背景光谱带中的来自所述样本的光发射分解所述N个样本图像中的至少一些以获得纯光谱贡献者图像，所述纯光谱贡献者图使用所述自发荧光丰度信息和所述纯光谱贡献者图像来确定所述多个非内源性光谱其中，对于暴露于所述背景激发带中的照射光的样本中的多个3基于多个位置中的每个位置处的自发荧光发射量和来自样本的自发荧光发射的至少献者图像对应于仅来自非内源性光谱贡献者中的不同的一个非内源性光谱贡献者的光发16.根据权利要求15所述的方法，还包括基于来自样本的自发荧光发射的至少一个纯每个非内源性光谱贡献者的光谱发射强度之和是所述背景光谱带中的总荧光发射强度的样本图像中的一个或多个样本图像的像素分类为不同的类别。23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述使用生物样本的自发荧光信息分解样本中的多个非内源性光谱贡献者的N个样本图分解所述N个样本图像中的至少一些以获得纯光谱贡献者图像，所述纯光谱贡献者图使用所述自发荧光丰度信息和所述纯光谱贡献者图像来确定样本中的多个位置处的在连接到所述处理设备的显示设备上生成包括非内源性光谱贡献者图像中的至少一4其中，每个样本图像对应于用于照射样本的照射光的波长带和其中，背景图像对应于用背景激发带中的光对样本的照射其中，对于用背景激发带中的光照射的样本中的多个非内源令使得所述处理设备从样本的背景图像获得样令使得所述处理设备使用所述自发荧光信息和来自样本的自发荧光发射的至少一个纯光令使得所述处理设备从所述背景图像确定自发荧光谱中的每个纯光谱对应于多个空间位置的不令使得所述处理设备基于所述多个位置中的每个位置处的自发荧光发射量和来自样本的5本中的每个非内源性光谱贡献者的光谱发射强度之和是背景光谱带中的总荧光发射强度令使得所述处理设备基于自发荧光信息将样本图像中的一个或多个样本图像的像素分类40.根据权利要求29所述的存储介质，其中，所述M个非41.根据权利要求40所述的存储介质，其中，所述M个非内源6[0002]本申请要求于2018年5月3日提交的美国临时专利[0003]本公开涉及生物样本的多光谱成像，特别是通过荧光显微(fluorescence[0007]本公开的特征在于用于测量已经施加了一个或多个染料或染色剂的样本中的自7并测量来自样本的光发射以获得N个样本图像，其中每个样本图像对应于照射光的波长带和光发射的一个或多个波长带的不同组合，其中光发射的一个或多个波长带定义波长范中对于暴露于背景激发带中的照射光的样本中的一个或多个非内源性光谱贡献者中的每波长带和背景激发带中激发样本后的、非内源性光谱贡献者的最大测量光谱发射强度的景光谱带内的每个波长处的光谱发射强度可以是在照射光的每个波长带和背景激发带中[0012]该方法可以包括在样本中的多个位置中的每个位置处确定来自样本的自发荧光[0013]该方法可以包括基于来自样本的自发荧光发射的至少一个纯光谱来分解N个样本[0016]M个非内源性光谱贡献者可以包括选择性结合到样本中的不同化学部分的一个或8设备的显示设备上生成包括非内源性光谱贡献者图像中的至少一个非内源性光谱贡献者背景图像对应于用背景激发带中的光对样本的照射和对背景光谱带中的来自样本的光发内源性光谱贡献者中不同的一个非内源性光谱[0021]对于用背景激发带中的光照射的样本中的一个或多个非内源性光谱贡献者中的[0024]来自样本的自发荧光发射的至少一个纯光谱包括来自样本的自发荧光发射的两对应于样本图像中的每个样本图像中的样本发射强度的值以对来自样本的自发荧光发射9[0028]M个非内源性光谱贡献者可以包括选择性结合到样本中的不同化学部分(moiety)[0034]图3是示出一组示例光谱发射带的示意图，该组示例光谱发射带可用于测量由于样本中的非内源性光谱贡献者引起的荧光发射和样本自发[0036]图5A-图5D是示出可用于测量样本荧光的四个外延滤光器(epi-filter)立方体的[0039]图6C是示出福尔马林固定的石蜡包埋的肺癌样本在以387纳米激发时和在以425[0040]图7A-7H是在光谱激发波长带和光谱发射波长带的不同组合中激发样本和测量样[0041]图8A-8H是从解混(unmix)样本图像和背景图像获得的、图7A-7H的样本的纯光谱[0043]图10A和10B是分别用于用多种非内源性染料制备的样本和未染色样本的图像集相关联的染料的贡献和由于样本自发荧光引起的荧光发射。虽然这些信号在光谱上重叠，[0046]多重免疫荧光标记是指在一个样本中靶向多种第一(primary)抗体，并且其可以子没有共价被结合到组织上，被配体结合的(ligand-bound)样本与配体结合(ligand-binding)蛋白质的孵育通常发生在多重染色方种方法和系统可以生成具有衍射受限的多光谱图像、具有跨样本的二维的多厘米视场通过使用在公共带处测量的图像以配准对应于所有样本成像带的图像来将图像集合组合可以被成像和准同配准(co-registered)。美国专利申请公开US2014/0193061的所有内容[0051]用于执行多光谱样本成像的前述方法可以确定在光谱解混期间来自样本自发荧定样本中的自发荧光)的估计而导出的，特别是当样本也包括多种荧光染料并且根据特定别是在样本内的不同结构当中，诸如不同类型的细胞和不同类型的细胞特征(例如，间质和/或可以指示某些条件的存在或不存在的感兴趣的细胞结构的报告者，并且可以提供关图像的分类操作的分析之外，本文描述的方法和系统允许显示更准确的光谱贡献者图像，的质量和效用。[0058]图1是示出用于对样本进行成像的一系列示例步骤的流程图100。在第一步骤102射隔离，并且使用合适的发射滤光器来测量，从而最小化由染料当中的光谱发射串扰和D2，每个染料具有发射光谱并分别在染料的发射光谱内的波长λD1和λD2处具有最大发射[0064]opal8多重IHC染色过程从一轮抗原修复开始，其可以经由微波处理使用缓冲剂[0069]每个抗体可在室温下孵育约30分钟。在第一抗体孵育后，使用opal8聚合物HRPAR6或AR9中经由微波处理的抗体剥离完成染色循环。可以对样本中的每个靶标重复前述5[0070]在施加了对应于样本内特定靶标的每个染料后，通过将[0071]染色样本(对其已经施加与特定样本靶标相关联的一个或多个染料，以及可选的一个或多个复染剂)可通过使用安装介质(例如，proLong8Diamond，可从ThermoFisher得一个或多个样本图像。在步骤104中获得的每个样本图像对应于激发带内的照射光和在[0075]可以使用各种不同的样本成像系统来获得样本图像。图2中示出了被实施为荧光这些组件中的每个组件都耦合到包括处理设备216的[0076]控制器214发送和接收来自每个系统组件的控制和数据信号，并且可以因此控制的外延滤光器立方体，该外延滤光器立方体中的每个可以被控制器214选择性地旋转到照[0080]从滤光器206射出的经过滤的照射光然后由透镜208聚焦到样本250的表面上，该样本250由安装在载物台210上的载玻片252支撑。载物台210允许样本250在x和y方向中的号以提取对应于样本250的测量信息的控制图像对应于滤光器206的激发波长带(其控制入射到样本250上的照射光的光谱分布)和滤光器206的一个或多个发射波长带(其控制由检测器212检测的来自样本250的荧光发射的个)背景图像对应于滤光器206的激发波长带和滤光器206的背景光谱带的组合。背景光谱带的重要方面在于其被选择而使得样本250中的非内源性光谱贡献者在背景光谱带内不生[0086]一组荧光发射光谱波长带和背景光谱波长带的一个示例示意性地在图3中示出。选择的波长带中激发样本并且然后测量背景光谱带X中的样本自发荧光来测量内源性样本的荧光发射来获得。用于检测来自样本的荧光发射的每个背景光谱带通常共享公共属性：[0090]图4是示出来自非内源性光谱贡献者的荧光发射和背景光谱带之间的关系的特性长范围内的特定波长处显示最大荧光强度Ima的荧光发射的强度为该非内源性光谱贡献者的最大荧光强度Imax的10％或更小(例如，8%荧光发射强度光谱E(λ)。还示出了背景光谱带Wback,emi(对应于光谱带X)。背景光谱带在任何波长带Wexc,i和Wback,exc中激发的非内源性光谱贡献者的最大荧光发射强度Imax的更小)。通过以这种方式选择背景光谱带X，由系统捕获的样本的背景图像几乎全部(或全杂的形状时，则基于背景光谱带的FWHM光谱范围来确定与背景光谱带相关联的波长范围。的非内源性光谱贡献者的荧光发射和背景光谱带之间的上述关系保持在波长范围λX1至λX2的非内源性光谱贡献者的积分强度(即，在波长λX1与λX2之间求和的发射强度)比当非内源性光谱贡献者在激发带Wexc,i中被激发时、跨由发射带Wemi,j定义的波长范围中的所有波长个非内源性光谱贡献者的荧光发射光谱的纯估计来解混背景图像(其可以是多光谱图像，该多光谱图像包括在背景光谱带X内的每个波长处以及在每个感兴趣的样本位置处的发射发荧光和生成自发荧光图像方面非常有效。光谱解混的合适方法例如在美国专利No.7,或所有位置处产生非内源性光谱贡献者的空间测量样本荧光以获得内源性自发荧光的准确定量确定的光谱带和/或波长的数量相对于传接调节样本图像中的测量强度值。例如，在一些样本的类型特定的自发荧光光谱。这些测量可以在同一样本的相邻系列切片(section)上实施)的经训练的机器分类器可以用于执行像素区域选择，并且可以以全自动方式提取材[0115]为了使用类型特定的自发荧光光谱来处理样本图像，样本的自发荧光图像被分素被解混以创建丰度向量A。就实际样本自发荧光被其类型特定的光谱比总体平均更好地游(downstream)分析中对对应于红细胞和/或胶原的像素的排除相结合。在从分析中优选于平均样本自发荧光光谱的自发荧光光谱的存活像素(诸如对应于间质细胞或对应于细胞所述的方法获得的样本的自发荧光图像可用于生成样本的合成H&E图像(或另一种类型的和系统对于隔离另外会干扰较弱信号的检测的样本自发荧光特别有用。作为另一个益处，获得的样本自发荧光图像可以用于准同配准来自连续成像会话[0120]用于获得样本图像的系统以及用于分析和分类光谱图像的方法的其他特征和方No.8,634,607；美国专利No.7,555,155；美国专利No.8,103,331；美国专利申请公开No.US2014/0193061；美国专利申请公开No.US2014/0193050；以及美国专利申请No.15/[0121]本文描述的任何方法步骤和其他功能可以由控制器214(例如，通过控制器214的处理设备216)和/或执行软件程序或硬件编码指令的一个或多个附加处理设备(诸如计算及用于向包括其他计算设备的其他电子组件发送和接收数据和控制信号的发送和接收单紫蓝黄红[0130]图2的系统的实施方式形成了在无限共轭下操作的复合外延照明荧光显微镜。所并且检测器是像素尺寸为3.63平方微米的SCMOSFlash2.8传感器(HamamatsuUS，[0132]三个样本图像被连续获得，其对应于样本对三个激发带中的每个激发带的响[0134]第三和第四滤光器立方体是单带滤光器，每个滤光器立方体有一个激发和发射机构的滤光器改变操作的数量，该图案依次为每个滤光器执行一组4排(line)的光栅图案包含对应于每个滤光器和激发组合的8个光谱通道的全载玻片拼接图像。对每个滤光器和了校正。然后，基于样本处的已知像素尺寸和光栅图案网格，它们被组装成拼接图器成像时产生的传感器处的像素偏移。除非二色性和发射滤光器元件完全没有楔形[0141]基于传感器处测量的像素偏移和0.5微6B示出了发射响应。图6C示出了福尔马林固定的石蜡包埋的肺癌样本在以387纳米激发和荧光的光谱库条目，没有免疫荧光标记的样本可以在8个单独光谱带中成像来获得测量图其他染料的单一染色染料样本的测量示出了在X带没有可测量[0153]表3示出了图像的每个染料的相对响应，其中所有光谱带都具有由最亮光谱带中们能够以曝光标度的计数对在不同光谱带具有不相等的曝光时间的情况下拍摄的图像进[0154]接下来，使用与上述相同的装置和方法对没有施加染料的两个FFPE样本进行成来自AkoyaBiosciences(Waltham，MA)的NuanceB软件将这些平面组装成图像立方体来[0157]在表4中给出了肺癌组织样本中对于四种类型的结构的得到的光谱及其平均，在表5中给出了乳腺癌组织样本中对于七种类型的结构的得到的光谱及其平均。所有这些都[0170]方程(2b)是中心光谱解混方程，其使得人们能够通过将给定像素处的测量光谱M乘以伪逆光谱矩阵S+来计算样本中纯光谱贡献者的丰[0173]得到的S+矩阵包含将样本像素的原始光谱测量M转换成时间标度的测量空间中纯[0174]对应于带B1-B7和X的原始样本图像在图7A-7H中示出，并且解混的纯光谱贡献者[0175]成对图像的比较证明了本文描述的方法和系统提供关于样本中分子靶标的准确[0176]但是在图7B中可以看到许多与样本中真实CD8定位无关的其他结构，这使得该图定位的几个微弱的CD8环特征。这无疑说明了多光谱成像和光谱解混作为隔离信号和去除在将所期望的成分从来自自发荧光的干扰中隔离出来时具有相当的有效性。在图8A中，光器的选择确实是最佳的而言，该图像中示出的信噪比(其有在没有其他混杂信号的情况下辨别所期望的DAPI信号的能力)说明了传统全载玻片成像可以实现的[0180]类似地，Opal570用于标记样本中的FoxP3蛋白质，其倾向于定位在调节性T细胞择为对施加到样本上的复染剂和(多个)染料尽可能不敏感，因此尽管存在4个或更多个染这使得在没有大量光谱通道的情况下更容易获得内源性样本自发荧光的准确估计。例如，为X光谱带被设计成仅对除内源性自发荧光以外的信号作出微弱响应。两个图像都示出了的带中的时间归一化响应相比，X带示出了对Opal620染料的响应1.4以及对Opal690染[0185]因此，图7H中的原始光谱图像包括与Opal620成分相关联的一些信号，以及与[0189]此外，因为本文描述的方法和系统直接获得样本的背景图像(其近似地——或者甚至几乎相同地——对应于样本自发荧光图像)，所以可以在解混样本图像以获得纯光谱自发荧光光谱的特性执行自适应光谱解混时，和/或当对应于某些样本结构(诸如红细胞和/或胶原)的像素从自发荧光图像中识别出并被标记(例如，以将这些像素排除在进一步像和自发荧光丰度Ax，而不是使用对应于带X的背景图像，解混来自非内源性光谱贡献者[0194]为了研究基于样本自发荧光图像的细胞计数，制备了肺癌样本的两个连续切试剂用多重面板(panel)染色，接下来与OpalPolaris780Anti-Dig(AkoyaBiosciences，[0197]在背景图像(假设其对应于样本自发荧光图像)的测量后，使用inForm8软件备的样本得到的图像集合，而图10B示出了从阴性对照样本(无染料)导出的图像集合。图10A和10B中的图像901示出了样本的[0199]另外，开发了一种细胞分割算法，使用inForm8软件中的胞核的对象(图10A和10B中的图像904)。在阴性对照样本(图10B中的图像904)中识别的所[0200]最后，来自两种算法(图10A和10B中的图像902和904)的掩模被组合以仅保留10A和10B中的图像905)示出了相对于图像904的