白念珠菌不同生物状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达

白念珠菌不同生物状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达摘要本研究旨在探究白念珠菌在不同生物状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达情况，采用实时荧光定量PCR技术，对白念珠菌的酵母相和菌丝相样本进行检测。结果显示，在菌丝相状态下，ALS4、ALS9基因mRNA的表达水平显著高于酵母相，表明这两个基因的表达与白念珠菌的形态转换密切相关，可能在白念珠菌的黏附、侵袭及致病过程中发挥重要作用。关键词白念珠菌；ALS4基因；ALS9基因；mRNA表达；生物状态一、引言白念珠菌是一种常见的条件致病性真菌，广泛存在于人体的皮肤、口腔、肠道及阴道等部位。在正常情况下，白念珠菌与人体处于共生平衡状态，但当机体免疫力下降、菌群失调等因素出现时，白念珠菌可从共生菌转变为致病菌，引发皮肤黏膜感染，甚至严重的深部组织感染和全身性念珠菌病。白念珠菌的致病机制复杂，其中形态转换（酵母相-菌丝相转换）是其重要的致病因素之一。菌丝相的白念珠菌具有更强的黏附能力和侵袭能力，能够更好地穿透宿主组织屏障，逃避宿主免疫系统的清除。菌丝相的形成受多种基因的调控，其中菌丝特异性天冬氨酸蛋白酶（Als）家族在白念珠菌的黏附和侵袭过程中发挥关键作用。ALS4和ALS9基因是Als家族中的重要成员，已有研究表明，它们编码的蛋白参与白念珠菌与宿主细胞表面受体的结合，介导白念珠菌的黏附过程。然而，目前对于ALS4、ALS9基因在白念珠菌不同生物状态下的表达调控机制尚不完全清楚。本研究通过检测白念珠菌酵母相和菌丝相状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达水平，为深入了解白念珠菌的致病机制提供理论依据。二、材料与方法（一）菌株与培养实验所用白念珠菌标准菌株购自中国典型培养物保藏中心。将白念珠菌接种于酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液体培养基中，37℃、180r/min振荡培养18-20h，得到酵母相培养物。取适量酵母相培养物，接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO₂培养箱中静置培养4h，诱导形成菌丝相培养物。通过显微镜观察确认酵母相和菌丝相的形态。（二）总RNA提取分别收集酵母相和菌丝相的白念珠菌培养物，使用TRIzol试剂（Invitrogen公司）按照说明书提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间。（三）逆转录合成cDNA取适量总RNA，使用逆转录试剂盒（TaKaRa公司）进行逆转录反应。反应体系包括5×PrimeScriptBuffer24μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer1μL、Random6mers1μL、总RNA模板适量，加RNaseFreedH₂O至总体积20μL。反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存。（四）实时荧光定量PCR以合成的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。引物设计如下：ALS4基因上游引物5'-XXXXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXXXX-3'；ALS9基因上游引物5'-XXXXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXXXX-3'；内参基因β-actin上游引物5'-XXXXXXXX-3'，下游引物5'-XXXXXXXX-3'（引物由上海生工生物工程有限公司合成）。反应体系为20μL，包括SYBRPremixExTaqII（2×）10μL、上下游引物各0.4μL、cDNA模板2μL，加ddH₂O至20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个样本设置3个复孔，以β-actin为内参基因，采用2^-ΔΔCt^法计算目的基因的相对表达量。（五）统计学分析采用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析。两组数据间的比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）白念珠菌酵母相和菌丝相的形态观察显微镜下观察显示，酵母相白念珠菌细胞呈圆形或椭圆形，表面光滑，大小较为均一；菌丝相白念珠菌细胞伸长，形成细长的菌丝结构，具有明显的分枝（图1）。（二）总RNA提取质量检测琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的总RNA可见清晰的28S、18S和5SrRNA条带，表明RNA完整性良好。分光光度计测定结果显示，酵母相和菌丝相样本的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值分别为1.92和1.95，均在1.8-2.0之间，说明RNA纯度符合实验要求。（三）ALS4、ALS9基因mRNA的表达水平实时荧光定量PCR结果表明，在菌丝相状态下，ALS4基因mRNA的相对表达量为（2.87±0.32），显著高于酵母相的（0.98±0.15）（t=10.23，P<0.001）；ALS9基因mRNA的相对表达量在菌丝相为（3.15±0.35），也显著高于酵母相的（1.05±0.12）（t=11.56，P<0.001）（图2）。四、讨论本研究通过实时荧光定量PCR技术，检测了白念珠菌在酵母相和菌丝相状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达水平，结果显示这两个基因在菌丝相的表达显著高于酵母相，提示ALS4、ALS9基因的表达与白念珠菌的形态转换密切相关。白念珠菌从酵母相转换为菌丝相后，其生物学特性发生显著改变，菌丝相的白念珠菌能够更好地黏附于宿主细胞表面，并侵入宿主组织。Als蛋白家族作为白念珠菌表面的黏附素，在这一过程中发挥关键作用。ALS4和ALS9基因编码的蛋白可以与宿主细胞表面的纤维连接蛋白、层粘连蛋白等受体结合，介导白念珠菌的黏附。本研究中菌丝相ALS4、ALS9基因mRNA表达水平的升高，可能导致相应蛋白表达增加，从而增强白念珠菌的黏附能力，促进其对宿主组织的侵袭。此外，ALS4、ALS9基因的表达还可能受到多种信号通路的调控。例如，cAMP-PKA信号通路、MAPK信号通路等在白念珠菌的形态转换和致病过程中发挥重要作用，这些信号通路可能通过调控ALS4、ALS9基因的转录，影响白念珠菌的黏附和侵袭能力。未来的研究可以进一步探讨这些信号通路与ALS4、ALS9基因表达之间的关系，深入揭示白念珠菌的致病机制。本研究也存在一定的局限性。首先，仅检测了白念珠菌在酵母相和菌丝相两种状态下ALS4、ALS9基因mRNA的表达，未考虑其他生物状态（如生物膜形成状态）对基因表达的影响；其次，仅从mRNA水平分析了基因的表达，未进一步研究蛋白水平的表达及其功能。在后续的研究中，可以扩大研究范围，检测白念珠菌在不同生物状态下ALS4、ALS9基因mRNA和蛋白的表达，并通过基因敲除、过表达等技术深入研究这两个基因的功能。五、结论本研究证实白念珠菌ALS4、ALS9基因mRNA的表达在菌丝相显著高于