第五章-酶分子修饰

第五章酶分子修饰酶分子修饰酶具有完整的空间结构和化学结构。结构改变会引起酶功能上的变化。分子结构决定了酶的性质和功能。赋予了催化效率高，专一性强和作用条件温和等特点。酶分子在动植物等生物体内经过长期的进化，对生物体内温和的环境较为适应。实际应用中，环境条件与生物体内条件很难一致，使酶的稳定性变差，催化效率下降等等。酶在实际应用中的局限性→酶分子修饰酶分子修饰的原因通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。酶分子修饰意义：提高催化效率增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性改变酶的专一性研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。酶分子修饰方法：（1）金属离子置换修饰（2）大分子结合修饰（3）侧链基团修饰（4）肽链有限水解修饰（5）核苷酸剪切修饰（6）氨基酸置换修饰（7）核苷酸置换修饰（8）物理修饰第一节金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。金属离子置换修饰（1）阐明酶的催化作用的分子机制（2）提高酶的催化效率（3）增强酶的稳定性，甚至改变酶的动力学性质金属离子构成酶的活性中心α-淀粉酶钙离子谷氨酸脱氢酶锌离子过氧化氢酶铁离子（1）除去金属离子，酶往往失活；恢复金属离子，酶活可以恢复或部分恢复（2）置换金属离子，改变酶活或酶的催化性质α-淀粉酶合适的钙离子存在，提高酶的稳定性；93~95℃仍能保持足够高的活性。各金属离子对不同来源的α-淀粉酶的活性影响不同。研究背景超嗜热微生物：最适生长温度为80—110℃范围的古菌和细菌。主要分布在80—115℃的超热的自然环境中。比如，海底热液口、深海热海底沉积物和流质喷气孔等环境中。来源于超嗜热微生物的酶：具有极高的热稳定性,通常能抵抗化学变性剂,如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境,其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。因此,超嗜热微生物酶已作为研究在极端条件下酶的进化、稳定性和活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生物催化性的模型。α-淀粉酶为重要的工业酶制剂之一,已被广泛应用在食品、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。目前工业用α-淀粉酶：最适作用温度较低，pH6.0存在的主要问题是热稳定性差,高于100℃和pH低于6.0时易失活,热稳定性依赖Ca2+的保护。可以在80—110℃范围内生长的超高温菌,是α-淀粉酶最重要的潜在来源。技术路线海底热液口的超高温古菌热球菌改良的YPS培养基培养产酶条件探索酶的纯化酶学性质研究→→→→研究结果菌株产酶条件的研究产酶时间：菌体生长9h进入平衡期；平衡期产酶达到最高,以后很快减少。产酶温度范围为60—90℃,低于60℃高于90℃产酶很少,最适产酶温度为80℃。产酶pH范围为5.0—9.0,当pH低于4或高于10时不产酶,最适产酶pH为7.5产酶NaCl浓度范围为0.5%—4.0%,2.5%为最适宜NaCl浓度培养基中不同碳/氮源对产酶的影响分子量为51.4kDa酶作用温度和热稳定性α-淀粉酶在pH为5.0或5.5,酶的最适作用温度均为95℃,在100℃仍有60%的酶活力(pH5.0)酶的热稳定性不依赖于Ca2+。

酶的热稳定性好,酶在90℃的半衰期为5h,100℃2h仍有40%的酶活。酶作用pH和pH稳定性α-淀粉酶的最适作用pH为5.0

在pH4.5仍有80%的酶活力,是酸性淀粉酶。在不同pH的缓冲液中，α-淀粉酶分别在80℃、90℃和100℃处理1h,pH在5.5—6.0均较稳定。不同pH的缓冲体系中,80℃处理2h,在pH5.0较稳定;80℃处理4h,在pH5.5—7.0比较稳定,在pH6.0的缓冲液中显示较高的稳定性金属离子和化学试剂对酶活力的影响分别研究1mmol/L和5mmol/L金属离子对酶活的影响。1mmol/L的Ca2+对酶的活性没有作用

5mmol/L的Ca2+对酶有较弱的抑制作用。1mmol/L和5mmol/L浓度的Mn2+、Ni2+、Ag+

、Al3+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+对酶具有抑制作用,其中的Zn2+、Cu2+、Hg2+对该酶具有较强的抑制作用。技术路线图尼罗罗非鱼脱氯水暂养2d取出全部肝脏肝脏淀粉酶酶活力研究→→→→一价金属离子对酶活力的影响钠、钾、锂对酶活力基本没有影响，酶活力相对稳定。二价金属离子对酶活力的影响铜对酶活力具有抑制作用,锌对酶活力没明显影响。铝对酶活力具有抑制作用,但效果不是很强烈；铁有促进作用,但促进的趋势则表现为先上升后下降,最高值达到130%。三价金属离子对酶活力的影响重金属离子对淀粉酶活力的影响镉、铅对淀粉酶的活力具有显著的抑制作用。离子浓度分别达到4mmol/L和5mmol/L时酶已全部失活。金属离子置换修饰的方法1.酶分离纯化2.除去原有的金属离子提取纯化的酶液→金属螯合剂（EDTA）处理→透析、超滤、分子筛层析等→除去EDTA-金属螯合物→无活性的酶（一般）3.置换为待研究的金属离子金属离子置换修饰的目的(1)阐明金属离子对酶催化作用的影响：(2)提高酶活力：(3)增强酶的稳定性：铁型超氧化物岐化酶分子中的铁离子被置换成锰离子后，对过氧

化氢的稳定性显著增强，对叠氮钠的敏感性显著降低。(4)改变酶的动力学特性：第二节大分子结合修饰采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。高尿酸血症成为痛风等系列疾病和肿瘤治疗中出现急性肾衰竭的直接原因。尿酸酶可能是未来治疗高尿酸血症的理想药物。然而，对于人体来说，尿酸酶是异源蛋白，直接使用，不仅体内半衰期短，而且易引起机体免疫反应。研究背景聚乙二醇（PEG）是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，本身无免疫原性和蛋白酶识别位点，对人体无毒性，用PEG活性酯修饰蛋白质药物可能掩盖其某些抗原决定位点和蛋白酶作用位点从而降低蛋白质免疫原性并保护其不被降解，而修饰后蛋白质分子量的增加有助于减小肾小球滤过率，增加药物在体内循环的半衰期。美国的PEG-重组猪尿酸酶结合物已进入三期临床试验阶段。我国缺乏类似的研究。主要技术路线菌种培养及诱导表达重组尿酸酶的分离纯化PEG-尿酸酶修饰→→结果还原性SDS显示为单一条带，非还原SDS显示为两条相邻的条带，原因：可能是酶分子亚基上存在链内二硫键，非还原条件下并非所有二硫键都打开，使亚基构像与还原条件下有区别，从而导致在凝胶中的泳动率有差异。重组尿酸酶亚基表观分子量约为33kDa。细菌培养→（超声或高压匀浆）破碎→30％～60％硫酸铵分级沉淀→透析和凝胶过滤层析→样品。高效液相色谱检测计算重组尿酸酶活性相对分子量约为130kDa；推测该酶可能是４个相同分子量亚基所组成的四聚体。PEG-重组尿酸酶修饰（1）用硼砂硼酸缓冲液（pH8.5、0.05mol/L）调节纯品尿酸酶溶液蛋白质浓度至４mg/ml。（2）(mPEG)2LYS

NHS:尿酸酶以10:1混合，置于４℃轻微振荡30min。（3）色谱分离，硼砂硼酸缓冲液洗脱，收集；（4）HPLC检测修饰情况。HPLC显示两个洗脱峰，前峰为PEG-尿酸酶结合物，后峰为Ｎ羟基琥珀酰亚胺，没有出现未修饰尿酸酶洗脱峰。将PEG-尿酸酶结合物进行还原性梯度SDS。SDS，出现了未修饰亚基和修饰亚基；修饰亚基的分子量分布在50～200kDa及以上，以100kDa居多；进行PAGE（５％分离胶，４％浓缩胶，１５μｇ蛋白上样量），样品弥散在浓缩胶和分离胶交界处，泳道下方没有任何条带出现；进一步将样品用HPLC检测，显示为单一峰。推测：几乎所有尿酸酶分子都被PEG修饰，但并不是每个亚基都结合了PEG。经测定，修饰后酶活约保留了修饰前的87.5％。测定修饰前后的酶学性质，对比发现PEG化尿酸酶的热稳定性和抗胰酶水解能力比天然酶有明显提高。最适作用pH为7.5，比之修饰前向中性偏移，这意味着修饰酶在人体血浆中能够更大程度发挥自身活力。最适作用温度在修饰前后均为40℃，但修饰后能够发挥有效酶活（大于60％）的温度范围变宽；修饰前后的pH稳定范围均为pH６～９1.修饰剂的选择常用的修饰剂：聚乙二醇，右旋糖酐，蔗糖聚合物，葡聚糖等等应用最广泛的是：聚乙二醇（PEG）；原因（1）PEG溶解度高，既能溶于水，又能溶于有机溶剂；（2）通常没有抗原性，也没有毒，生物相容性好。

（3）分子末端有2个羟基，可用甲氧基化封闭其中一个，使之

成为单甲氧基聚乙二醇。大分子结合修饰的方法2.修饰剂的活化作为修饰剂的大分子，往往需要活化后，才能去修饰酶分子。例如，PEG甲氧基化

MPEG3.修饰活化的修饰剂与酶液适当混合，在一定的温度和pH等条件下反应，使修饰剂与酶分子侧链基团共价结合。4.分离5.评价修饰后的酶活和酶性质改变情况。大分子结合修饰的作用总结(1)通过修饰提高酶活力(2)通过修饰可以增强酶的稳定性(3)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性第三节侧链基团修饰采用一定的方法（一般为化学法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。（1）蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。（2）核酸类酶主要由核糖核酸（RNA）组成，酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基（酮基）等。氨基修饰采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。常用的氨基修饰剂：亚硝酸、2，4-二硝基氟苯（DNFB）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、乙酸酐、琥珀酸酐……1.亚硝酸修饰天冬酰胺酶

稳定性大大提高，体内的半衰期延长2倍2.

2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）修饰酶分子赖氨酸残基上的氨基→酶-三硝基苯衍生物酶-三硝基苯衍生物在420nm和367nm有特定吸收峰，→测定酶蛋白赖氨酸的数量。羧基修饰：

采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变的方法称为羧基修饰。

巯基修饰：

采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。

胍基修饰采用二羰基化合物与（精氨酸残基）胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构象的方法称为胍基修饰。酚基修饰通过修饰剂的作用使酶分子上的（酪氨酸残基）酚基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象和特性的修饰方法称为酚基修饰咪唑基修饰通过修饰剂与咪唑基反应，使酶分子中的（组氨酸残基）咪唑基发生改变，从而改变酶分子的构象和特性的修饰方法成为咪唑基修饰。吲哚基修饰通过改变酶分子上的（色氨酸残基）吲哚基而使酶分子的构象和特性发生改变的修饰方法称为吲哚基修饰。分子内交联修饰含有双功能基团的化合物（又称为双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。第四节肽链有限水解修饰在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。酶蛋白的肽链被水解，可能会出现的情况：酶活性中心被破坏，活性丧失或降低。酶活性损失不多，其他特性（抗原性等）变化,提高药用酶的价值。酶活性中心形成，酶活性提高。胰蛋白酶原没有催化活性，只有在胰蛋白酶或肠激酶的作用下，切去N-端六个肽，就显示出胰蛋白酶的催化功能。胃蛋白酶以酶原的形式表达。胃蛋白酶原无活性，其一级结构比胃蛋白酶多出了44个氨基酸。当胃消化食物时，胃壁细胞释放胃蛋白酶原和盐酸。在酸性环境中，胃蛋白酶原发生去折叠，以自催化方式对自身进行剪切，从而生成具有活性的胃蛋白酶。意义：没有食物消化时，保持酶原形式，避免了过量的胃蛋白酶对胃壁自身进行消化，是一种保护机制。胃蛋白酶原的自激活胰凝乳蛋白酶原的激活Klenow片段第五节核苷酸链剪切修饰在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为核苷酸链剪切修饰。多功能核酸类酶L-19IVS的形成四膜虫rRNA前体经过自我剪接作用形成成熟的rRNA；同时生成414nt的G-IVS。G-IVS切除5’端15nt核苷酸后环化。再开环切除5’端4nt核苷酸形成395nt的多功能核酶L-19IVS。第六节氨基酸置换修饰酶蛋白中各种氨基酸的有序组成和排列是酶的化学结构和空间结构的基础。肽链上某个氨基酸的改变将引起酶的结构改变，从而改变酶的特性和功能。氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某个氨基酸替换为另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。氨基酸置换修饰的作用提高酶的催化效率例：酪氨酸-RNA合成酶，第51位的苏氨酸（Thr51）转换为脯氨酸，其催化效率调高25倍。增强酶的稳定性例：T4溶菌酶分子第3位的异亮氨酸（Ilu3）置换为半胱氨酸后，Cys3可以与Cys97形成二硫键，热稳定性大大提高。改变酶的专一性例：枯草杆菌蛋白酶活性中心上的丝氨酸用化学修饰的方法置换成半胱氨酸，该酶失去水解蛋白质和多肽的能力，但是能催化硝基苯酯进行水解。氨基酸置换修饰的方法化学修饰法：蛋白质工程：利用基因操纵技术（定点突变）。化学修饰法定点突变法研究背景白念珠菌是目前临床最常见的条件致病性真菌，常引起免疫力低下患者的感染。氟康唑是治疗白念珠菌的抗真菌药物；但是白念珠菌对氟康唑的耐药性提高。α脱甲基酶是白念珠菌细胞壁合成途径中的关键酶，也是氟康唑作用的靶酶。α脱甲基酶基因（ERG11）容易突变，引起氨基酸置换，导致氟康唑与其的亲和性下降，使白念珠菌对氟康唑产生耐药性。技术方法路线构建野生型Ｔ质粒白念珠菌敏感质控株（ATCC90028）构建定点突变Ｔ质粒酿酒酵母的异源性表达野生型酿酒酵母表达质粒定点突变酿酒酵母表达质粒

药物敏感性表型检测体外氟康唑药物敏感性表型检测显示与野生型重组质粒比较，K143Q突变型重组质粒的氟康唑的最低抑菌浓度明显增加，增加达16倍。即α脱甲基酶的143位赖氨酸（K）置换为谷氨酰胺（Q）后，对氟康唑的耐药性增加。第七节核苷酸置换修饰核酸类酶的基本组成单位是核苷酸。特定位置的核苷酸是此类酶化学结构和空间结构的基础。核苷酸置换修饰，将核酸类酶分子上某一核苷酸置换成另一个核苷酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。第八节物理修饰通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特性的方法，称为酶分子的物理修饰。物理修饰特点酶分子的组成基团，分子中的共价键不发生改变，仅副键在物理因素下，发生变化和重排，从而影响酶的空间构象。例如羧肽酶γ→高压修饰：水解能力降低，多肽合成能力提升。纤维素酶→高压修饰：酶活性提高10%。胰蛋白酶→盐酸胍处理→透析除去盐酸胍→不同温度下重建酶的构象→50℃下重构的酶稳定性比天然酶提高5倍。物理修饰作用（1）提高酶的催化活性；（2）增强酶的稳定性；（3）研究极端条件下酶的