生物人教版选修3教学课件：1.2　基因工程的基本操作程序（36张）

1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上

游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的1.目的基因的获取目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因等，也可以是一些具有调控作用的因子。获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取

（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（1）从基因文库中获取基因文库基因组文库部分基因文库cDNA文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。受体菌中包含了一种生物所有基因，这种基因文库叫做基因组文库。受体菌只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库基因组文库和部分基因文库（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。（2）基因文库如何构建？将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。

如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。两种基因文库的主要区别如下表所示：cDNA合成过程

第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。（2）PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_____方式扩增，

即____（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；

过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃引物与部分模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸比较DNA复制和PCR技术（3）人工合成基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接合成。比较项目DNA复制PCR技术解旋方式场所酶温度条件合成对象联系区别解旋酶催化高温变性解旋细胞内（主要是细胞核内）细胞外（在PCR扩增仪内）DNA解旋酶、DNA聚合酶等热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行DNA分子DNA片段或基因模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸酶：均需要DNA聚合酶进行催化引物：均需引物，使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸核心2.基因表达载体的构建

过程：质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。表达载体需具备的序列：

启动子目的基因终止子标记基因复制原点启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段，使转录在所需要的地方停下来。复制起点：复制起始的一段序列3.将目的基因导入受体细胞植物：动物：微生物：（一）转化：（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达农杆菌转化法过程显微注射法过程目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵

新性状动物将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：

用Ca2+处理细胞

感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交（1）、检测目的基因是否导入受体细胞①首先取出转基因生物的基因组DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中方法:DNA分子杂交过程:知识延伸——DNA分子杂交技术

该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。归纳步骤4、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交方法:抗原抗体杂交②过程: