生物人教版选修3教学课件：1.2　基因工程的基本操作程序（27张）

基因工程的基本操作程序据媒体报道，科学家受萤火虫启发，培育出真正的发光植物，项目的团队人员称，研制发光的未来树木可以作为路灯使用。研究团队首先利用荧光蛋白，通过软件设计出了DNA序列即荧光基因，将荧光基因转移到重组质粒转化农杆菌中，最终介导到一种名为拟南芥的微小植物中，由于它们能够彼此之间和与植物之间传递DNA，而且这种植物易于试验，传播到野外的风险最小，因而它们越来越多的被用于遗传工程学。【课题】利用萤火虫的发光特性，来改造银杏树，使它成为发光树。发光基因哪里去找？如何获取发光基因？步骤一、获取发光基因（目的基因）发光基因（编码蛋白质的基因）荧光蛋白的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列DNA的核苷酸序列推测化学合成推测1、人工合成法资料1：基因文库的建立基因文库包括基因组文库和部分基因文库。将某种生物的全部DNA，酶切成许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。如果这个文库包含了某种生物的所有基因，这种基因文库叫做基因组文库；如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例如cDNA文库，首先得到mRNA，再反转录得cDNA，形成文库。资料2：从基因文库分离目的基因使用基因文库是分离基因，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。如果一个哺乳动物的基因组是

3×109碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的DNA片段在技术上是很困难的。但是在基因文库中，只要有该基因的探针存在，采用DNA分子杂交技术即可分离并获取目的基因。

步骤一、获取发光基因（目的基因）2、从基因文库获取供体生物mRNA单链DNA反转录（酶）

双链DNADNA聚合酶反转录法步骤一、获取发光基因（目的基因）供体生物全部DNADNA片段酶切导入受体菌群（基因组文库）目的基因2、从基因文库获取导入受体菌群（cDNA文库）目的基因分离分离真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游步骤一、获取发光基因（目的基因）3、利用PCR技术对目的基因的获取与扩增PCR是聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）的缩写，它是在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，只需在试管中建立反应，经数小时后，就能将极其微量的目的基因或某一特定DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍。其原理与细胞内发生的DNA复制过程非常相似，PCR也是一个重复进行DNA模板解链、引物与DNA模板结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，只不过该过程主要是通过人为控制反应体系的温度来实现的。关键词体外复制温度②条件：a、模板：___________________________、b、原料：___________________________、c、酶：_______________________、d、一对引物已知基因的脱氧核苷酸序列四种（三磷酸）脱氧核苷酸热稳定性DNA聚合酶①过程：a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在高温作用下，_____断裂，形成单链DNAb、复性（退火55℃-65℃）：系统温度降低，_____与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在_____酶的作用下，合成与模板互补的DNA链。氢键双链Taq引物引物的设计要求引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效引物Ⅰ′和引物Ⅱ′之间局部发生碱基互补配对而失效（引物长度一般为20-24个核苷酸，不宜过短，以防止引物碱基配对随机结合。）【疑问】

发光基因能否直接导入受体细胞？导致发光基因在受体细胞不能稳定存在，遗传给下一代，并且发光基因无法表达和发挥作用。项目PCR技术DNA复制不同点解旋方式场所酶温度条件结果DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶需控制温度,在较高温度下进行细胞内温和条件在短时间内形成大量的DNA片段形成2个DNA分子解旋酶催化步骤二、构建发光基因表达载体一个完整的基因表达载体的组成？启动子终止子起始密码子终止密码子用EcoRⅠ切割质粒和含目的基因的外源DNA，形成重组DNA，理论上讲，两个DNA片段形成重组DNA可能有“

”、“

”、“

”三种。思考：要避免这种任意连接问题，应选择的酶为

？步骤三、发光基因导入受体细胞农杆菌转化法（经济有效：80%转基因植物通过此方法获得）

①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。受体细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法受体细胞转化过程农杆菌转化法体细胞目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体DNA上→表达显微注射法受精卵目的基因表达载体的提纯→取卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理法原核细胞Ca2+处理细胞→感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子步骤四、发光基因的检测与鉴定检测发光基因是否成功导入？检测发光基因是否成功表达？①首先取出转基因生物的基因组DNA②含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中1、导入检测：DNA分子杂交法（使用DNA探针）2、表达检测：a、转录检测：分子杂交法检测mRNAb、翻译检测：免疫法，提取蛋白质用相应的抗体进行抗原—抗体杂交3、个体生物学水平鉴定：如作物抗性等。分子水平检测个体水平鉴定抗原-抗体分子杂交技术DNA分子杂交技术DNA-RNA