CN112662766B 一种基于高通量测序技术检测家族性胸主动脉瘤和夹层相关突变基因的方法 （赣南医科大学第一附属医院）

.CNKI.2020,3-8.一种基于高通量测序技术检测家族性胸主本发明公开了一种基于高通量测序技术检测家族性胸主动脉瘤和夹层相关突变基因的方本专利发明基于目标区域捕获高通量测序技术流程，通过选取与FTAAD相关的12个致病基因集合，使用多重PCR捕获流程一次性检测12个致病21.一种基于高通量测序检测家族性胸主动脉瘤和夹层相关突变基因的文库构建方法，（4）利用接头序列对纯化后的所述第1轮多重PCR扩增产物进行第2轮接头序列PCR反所述试剂盒包括1管Primerpool试剂，所述Primerpool试剂共包含3所述试剂盒还包括保存在-20℃的1管IGT-I7Index10uM试剂、1管IGT-I5Index 所述第2轮接头序列PCR反应的反应液包括：PCRproductmixture：13.5ul，IGT-I53带与家族性胸主动脉瘤和夹层(familialthoracicaorticaneurysmanddissection，15％的家族性TAAD。携带致病基因突变但暂无临床症状的患者可进行疾病早期预测和干可检测突变，但只能检测到SNP等单核苷酸的已知变异。测序技术是基因突变检测的金标4对该技术问题采用多重PCR捕获技术，将FTAAD的致病基因集合利用扩增原理予以捕获富[0013]其中5管试剂保存在-20℃,包括(10uM)试剂、1管Primerpool试剂、1管IGT-EM808polymerasemixture试剂和1管EnhancerbufferNB(1每个扩增子均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQID5[0022](3.2.1)向30ul步骤(3.1)处理的PCR产物中并加入27ul室温平衡后的AMPureXPmixture为步骤(3.2.10)获得的纯化后的多重PCR6[0045](3.4.8)将离心管从磁力架取下，加入24μl的Nuclease-freewater或者1×TE[0051]将步骤(3.6)获得的合格的多重PCR文库使用HiseqXtenPE150进行测序获得基[0053](5.1)下机数据Fastq格式质量控制：对每个样本文库和lane产生的每对原始[0054](5.2)比对Alignment：使用软件bwa，把序列Cleanreads与人类参考基因组7[0056](5.4)变异检测：使用GAT5.2||FS>52.254||SOR>9.044||ReadPo[0059]为了获得更好的技术效果，在步骤(3.1)之[0063]步骤(3.4)获得的多重PCR文库Aligent2100片段结果在250bp-350bp之间即为合[0068]本专利发明基于目标区域捕获高通量测序技术流程，通过选取与FTAAD相关的12过基因检测技术解读FTAAD相关的基因变异情况，多基因变异分析的结果参考美国遗传学会(ACMG)、分子病理学会(AMP)和中华医学会心血管病学分会精准心血管病学学组等发布8[0077]选取特异有效基因集合对疾病突变基因筛查非常关键，[0083]其中5管试剂保存在-20℃,包括(10uM)试剂、1管Primerpool试剂、1管IGT-EM808polymerasemixture试剂和1管EnhancerbufferNB(1每个扩增子均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQID9[0098](3.2.1)向30ul步骤(3.1)处理的PCR产物中并加入27ul室温平衡后的AMPureXP[0120](3.4.8)将离心管从磁力架取下，加入24μl的Nuclease-freewater或者1×TE[0128]步骤(3.4)获得的多重PCR文库Aligent2100片段结果在250bp-350bp之间即为合[0130]将步骤(3.6)获得的合格的多重PCR文库使用HiseqXtenPE150进行测序获得基[0132](5.1)下机数据Fastq格式质量控制：对每个样本文库和lane产生的每对原始[0133](5.2)比对Alignment：使用软件bwa，把序列Cleanreads与人类参考基因组[0135](5.4)变异检测：使用GAT20.0||MQRankSum<‑12.49||ReadPosRankSum<‑3.721，Indel过滤条件为：QD<5.2||FS>52.254||SOR>9.044||ReadPo[0146]i)通过数据库对照收集的变异信息，依次判断每个变异是否满足ACMG/AMP指南基因的筛选及使用多重PCR技术捕获相关基因的实验流程及解读方法。准确解读变异与疾[0158]本发明技术采用多重PCR捕获技术，将选取的特定有效基因集合利用扩增原理予[0159]一种基于高通量测序技术用于FTAAD致病基因突变的检测方法和应用，特征为①基因外显子和两侧各延伸15bp的区间。③配合Illumina公司公布的MiniSeq，NextSeq，[0160]本发明可能在基于高通量测序技术下变形方案有1.致病待检基因从基因组特异性富集方法如从多重PCR变更为杂交捕获或选择性环化，2.基于Illumina以外测序平台所用探针变更接头和PCR扩增条件和实验流程，3.基于Illumina以外测序平台所用测序方法123456789ABCDEFGH括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQIDNo.1-SEQID[0006]<120>一种基于高通量测序技术检测家族性胸主动脉瘤和夹层相关突变基因的<170>PatentInversion3agatatagatgaatgtgaagacttgaacaatgcaagaaaaataaataggttccagccactggcttagacatcaggagaaactaacgctgggatgggatattctataaaatgggggtcgaggaaatcccttaaccccggattgtgacacaccagctacaagggaacctacactgcttacaccagtggaaatcaggagctcttccacacacgtgtacaaggtgagtggacaagactgcatcttcctgaccaagttaccccattggatcaccatcactatcccaagttccttccacgtcttggcatgactccagcttggactcaagggaaaaaaggtgatttcagaagaaaccttgagattttttctatgaaaatttaaagcttaaaagcagatctgaagaaaaaatggcagttggataatcattggtgccctttggatctcttaattttttatacaattttcattctgatggattgtccctaaaaaaggagcttaagtatcttgtttagggggattgacatgataaggagcttaagtatcttgtttagggggattgacatgataggaaaaagaaatactgaggacctagaggggtagggagttgtggacctttgataccctaaaaataaggtaaatttcagaaaacaagtctctagtaagtctcaaatgaaatgtttgatctgttttagtaatgtcatgatcatgtacgaacaagaggaacacatatgactacagggcagaataatagtagcaagtaattttcatgcacctccagtgagtcttcaactcatgaccagccattcagagcatgctttaatcttctctacctgaaaataaagatatc