生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测-高通量飞行时间质谱法团体标准征求意见稿

附件1

ICS11.220

B41

团体标准

T/CAQI**—2020

生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检

测--高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）

Detectionofsinglenucleotide

polymorphism(SNP)inbiologicalsamples

MALDI-TOFMSmethod

（征求意见稿）

2020-**-**发布2020-**-**实施

中国质量检验协会发布

1

生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--

高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）

1适用范围

本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。

本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭

子、唾液等。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，

仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包

括所有的修改单)适用于本文件。

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家

卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）

个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，

国卫办医函〔2017〕1190号）

感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公

厅，国卫办医函〔2017〕1190号）

农业部1782号公告-12-2012转基因生物及其产品食用安全检测蛋白

质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法

卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》

的通知(卫办医政发〔2010〕194号)

3、术语和定义

3.1rs和ss体系SNP

由美国国立生物技术信息中心（nationalcenterforbiotechnology

3

information，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系

的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（referenceSNP），ss体系

的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submittedSNP）。

3.2单核苷酸多态性（SNP）

是指由单个核苷酸-A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，

造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。

3.3等位基因（allele）

一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态

的一对基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状

来说是纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是杂合

子。

3.4生物标记物（biomarker）

患者标本中所含有的一种特殊的分析物质（如DNA、RNA、蛋白质等），

可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药或新疗法在目标人群中的安全性和有

效性。

4原理

样本通过PCR扩增出含有SNP位点的一段DNA，用SAP酶去除掉

PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物，然后加入一单

碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，采用四种ddNTP替代dNTP。

这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点

的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)

检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。

5试剂与耗材

除另有规定，所用试剂均为分析纯。

纯水；PCR缓冲液,10x(含20mMMgCl2)；MgCl2，25mM；聚合酶，

5U/µL；dNTPMix，25mM；超纯水>18Mohm；SAP缓冲液，10x；虾碱

酶1.7U/µL；iPLEXGOLD缓冲液；iPLEXTerminationMix；iPLEXEnzyme；

4

3-Pt标准品；100%乙醇，HPLC级别；基因芯片。可根据实验需求，选择

其他型号的同等功能的试剂和耗材。

6仪器与设备

超净工作台或生物安全柜、PCR扩增仪、纯水仪、电离飞行时间质谱

仪（MALDI-TOFMS）、涡旋震荡仪、离心机、摇床、自动化核酸提取仪。

7操作步骤

7.1样品的预处理

1）、口腔拭子

口腔拭子（无保存液）

A1.向干净的2ml离心管中加入300μLBufferES。

A2.将拭子采样一头剪下，完全浸泡入2ml离心管中。

A3.加入30μL10×PKBuffer和10μLProteinaseK（20mg/ml），56℃

处理30分钟。

A4.将处理后的液体全部转移至反应板中。

口腔拭子（有保存液）

Proteinase法：向装有拭子和保存液的管中加入30μL10×PKBuffer和

10μLProteinaseK（20mg/ml），56℃处理30分钟。将处理后的液体全部

转移至反应板中。

2）、唾液（无需预处理）

3）、血液（无需预处理）

4）、血卡

B1.向干净的2ml离心管中加入20μLProteinaseK（20mg/ml）和250μL

Buffer1xCRS。

B2.取一片直径6mm血卡至B1所述离心管中，使血卡完全浸入液体。

B3.56℃，900rpm振摇处理1h。吸取所有上清转移至反应板进行自动

化处理。

7.2核酸提取

使用自动化核酸提取仪进行自动化提取。

5

7.3PCR反应

PCR反应试剂种类及用量和反应条件见表5和表6。

表1PCR反应试剂种类及用量

反应物名称反应终浓度用量

模板DNA(10ng/µl)/1µL

引物Mix（0.5μM）0.1µM1µL

10x缓冲液（含Mg2+）

2mMMgCl20.5µL

MgCl2(25mM)2mM0.4µL

dNTP(25mM)500µM0.1µL

聚合酶(5U/µl)1Unit0.1µL

水，HPLC级别/1.9µL

总体积/5µL

表2PCR反应条件

扩增温度反应时间备注

95℃2min（预变性）

95℃30s

56℃30s45个循环

72℃60s/

72℃5min/

4℃保存/

7.4SAP消化反应

1）、7.2PCR后的反应板放入离心机中2000rpm离心1min。

2）、配制SAP酶Mix，反应体系见表7：

表3SAP消化反应体系

反应物名称浓度用量

SAP缓冲液,10x/0.17µL

虾碱酶1.7U/µL0.3µL

6

水/1.53µL

总量/2µL

3）、取2uL的Mix加入到每个孔中，来回吸打，保证混匀，将封口膜盖紧。

4）、在PCR仪中进行SAP酶消化。

表4PCR反应条件

扩增温度反应时间

37℃40min

85℃5min

4℃保存

7.5单碱基延伸

1）、SAP反应板放入离心机中2000rpm离心1min。

2）、配制延伸Mix

表5反应物名称及用量

反应物名称反应终浓度用量

终止引物Mix2-5uM0.94µL

Gold缓冲液1x0.2µL

Terminationmix/0.1µL

iPLEXEnzyme0.3U/µl0.021µL

水/0.739µL

总量/2uL

3）、取2ul的Mix加入到每个孔中，并来回吸打，保证混匀，将封口膜盖紧。

4）、离心后，在PCR仪进行下列反应。

表6PCR反应条件

扩增温度反应时间

7

94℃30s

94℃5s

52℃5s40个内部循环

5个内部循环

80℃5s

72℃3min

4℃保存

7.6仪器分析条件

检测器：电子倍增管；激光器波长：337nm，氮分子激光器；飞行距离：800mm；

分辨率：16道尔顿。

8结果分析

利用质谱分析软件，分析基因位点的型态，部分基因位点型态见表7。更多基因

位点可参考药物基因组学数据库Drugbank,Dgidb,PharmGKB。

表7基因简称和位点的型态

基因简称位点正常型变异型

PTGS1rs10306114AG

ADRB2rs1042713GA

LPArs10455872AG

ABCB1rs1045642AG

G6PDrs1050828CT

CYP2C9rs1057910AC

CYP2D6rs1065852GA

C11orf65rs11212617CA

CYP2C19rs12248560CA/T

COMTrs13306278CT

HTR2Crs1414334CG

PRKCArs16960228GA

ANKK1rs1800497GA

TNFrs1800629GA

NAT2rs1801280TC

CRHR1rs1876828CT

GRIK4rs1954787TC

KIF6rs20455AG

ABCG2rs2231142GT

8

EPHX1rs2234922AG

CYP3A4rs2740574CT

CYP2D6rs28371706GA/T

CYP2D6rs28371725CT

CYP2C19rs28399504AG

CYP2B6rs3745274GA/T

SCN1Ars3812718CT

DPYDrs3918290CG/T

CYP2C19rs41291556TC

UGT1A1rs4148323GA

SLCO1B1rs4149056TC

CYP2C19rs4244285GA

COMTrs4680GA

COQ2rs4693075GC

FKBP5rs4713916AG

CYP2C19rs4986893GA

CYP2D6rs5030656CTT-

KCNJ11rs5219TC

CYP2C19rs56337013CT

CYP2D6rs59421388CT

CYP2D6rs61736512CT

HTR1Ars6295CG

APOA5rs662799GA

VKORC1rs7294CT

LTC4Srs730012AC

APOErs7412CT

CYP3A5rs776746CT

CRHR2rs7793837AT

HTR2Ars7997012AG

UGT1A1rs887829CT

VKORC1rs9934438GA

CYP1A2rs762551CT

CYP2C8rs7909236CT

9结果表述

根据检测结果和表7及药物基因组学数据库的数据，对具体基因位点结果判

断为：野生型（正常型）、杂合型及突变纯合型。

9

T/CAQI00*—2020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国质量检验协会提出并归口。

本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院综合检测中心，中检科创（北京）

测试认证有限公司，中检智联（北京）科技有限公司，溯源生命生物工程股份

有限公司，北京晗旭健康管理集团有限公司，中检汇德健康管理（北京）有限

公司，大连国际旅行卫生保健中心，北京智康源基因科技有限公司、国正检验

认证有限公司，北京佳安卫康科技有限公司，北京金马晟和科技有限公司，基

谱生物科技（上海）有限公司

本标准起草人：乐粉鹏、姚李四、程邦荣、万谦、张建国、邓滨昌、李洋、周

立成、袁吉泽、姜成涛、高玉峰、聂绚丽、陈菊如、郭汉文

2

生物样本的单核苷酸多态性（SNP）位点检测--

高通量飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）

1适用范围

本标准为检验实验室进行药物靶点基因的检测提供技术指导。

本标准适用的样本包括：全血标本、石蜡包埋组织、干血片、口腔拭

子、唾液等。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，

仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包

括所有的修改单)适用于本文件。

药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)，（2015年国家

卫生和计划生育委员会医政医管局国卫医医护便函〔2015〕240号）

个体化医学检测微阵列基因芯片技术规范（国家卫生计生委办公厅，

国卫办医函〔2017〕1190号）

感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南（国家卫生计生委办公

厅，国卫办医函〔2017〕1190号）

农业部1782号公告