肺炎支原体耐药现状及耐药基因检测方法研究进展总结2026

肺炎支原体耐药现状及耐药基因检测方法研究进展总结2026肺炎支原体（mycoplasmapneumoniae，MP）是一种介于细菌和病毒之间的无细胞壁、形态多样且能通过除菌滤器的最小原核细胞微生物，可独立生存。MP是导致社区获得性肺炎的最常见病原体之一，其所引发的肺炎支原体肺炎（mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP）通过呼吸道飞沫传播

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。MP感染不仅会导致呼吸道疾病，还可能引发脑膜炎、脊髓炎等肺外并发症。MP流行具有间接性、周期长、播散慢的特点，高峰每几年出现1次

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。MP耐药性已成为全球公共卫生重大挑战，因MP缺乏细胞壁，天然对磺胺类、β-内酰胺类抗生素耐药，故治疗MP相关疾病常使用大环内酯类、氟喹诺酮类和四环素类抗生素。全球范围内，MP的大环内酯类耐药率逐年上升，其中大环内酯类耐药肺炎支原体（macrolide-resistantmycoplasmapneumoniae，MRMP）感染可导致退热延迟、病程延长等不良临床结局

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3,4,5］

。目前虽已明确MP的临床和实验室标准研究方法及耐药临界点，但因其生长缓慢、培养困难，故主要借助PCR和测序确定耐药性。虽然MP是导致儿童非典型肺炎的主要病原体，但近年来成人发病率亦呈上升趋势

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6,7,8,9,10,11］

。本文综述了MP的耐药现状以及各类MP耐药基因检测方法的原理、优势、局限性，旨在为临床治疗和耐药监测提供参考依据。一、耐药现状1.全球耐药性分析：MP对大环内酯类的耐药性呈现地域异质性。亚洲地区耐药形势最为严峻，中国部分区域耐药率超过90%

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，日本、韩国分别为50%~70%和60%~80%。而欧洲、美洲及大洋洲耐药率普遍低于10%

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。MP耐药主要与23SrRNA基因突变有关，A2063G是最常见突变，A2063T/C、A2064G等是罕见突变，单突变（A2063G）和双突变（A2063G+A2064G）对临床结局也存在差异影响

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17,18,19］

。MP耐药率呈现地域异质性，本质上是由于全球公共卫生治理体系不健全，主要是因为抗生素使用政策差异、耐药监测体系不完善以及MP基因型区域性分布的差异。2.耐药性对临床治疗结局的影响：在大环内酯类耐药率较高地区，MP耐药性直接导致治疗失败率攀升，患者使用一线药物后，症状难以缓解，甚至加重

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。因四环素类与氟喹诺酮类抗生素在儿童群体中使用受限，儿童MRMP感染的临床治疗选择匮乏，治疗难度大增。临床医师被迫采用二线或三线抗生素，这不仅提升了药物不良反应风险，还可能推动这些抗生素的耐药率上升，形成恶性循环。MP耐药率的升高加重了医疗负担，给公共卫生系统带来了严峻挑战，亟待通过合理使用抗生素、强化耐药监测、研发新治疗策略等措施加以应对

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。3.耐药性流行的驱动因素：MP耐药性的广泛流行受多种因素驱动。抗生素的不合理使用是主要原因，尤其是亚洲国家，大环内酯类被广泛用于呼吸道感染的治疗，甚至在缺乏明确病原学诊断时仍被频繁使用，加速了耐药菌株的选择和传播。基因突变在耐药性流行中起重要作用，尤其是23SrRNA基因的突变。gyrA、gyrB、parC和parE基因突变则与氟喹诺酮类耐药相关。突变菌株借克隆传播或水平基因转移在人群中扩散，加剧耐药问题。环境与宿主因素也影响MP耐药性的流行，人群密集地区易发生MP传播，宿主免疫状态及基础健康状况等都会影响耐药菌株的定植与传播。二、耐药基因检测方法MP是呼吸道感染的重要病原体，可引起肺内外多种病变。MRMP的出现给临床治疗带来了困难，快速准确地识别耐药菌株感染，对病情的判断和耐药控制意义重大

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。鉴于耐药性问题愈加严峻，而MP生长缓慢，药物敏感实验耗时数周，血清学方法不能识别MRMP，故快速检测技术的重要性日益凸显，临床诊断需要依靠分子生物学技术

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。用于鉴定MP耐药基因的分子检测方法主要包括基于核酸扩增技术的PCR、实时PCR等；基于测序技术的焦磷酸测序（pyrosequencing，PSQ）、全基因组测序（wholegenomesequencing，WGS）等；基于杂交技术的斑点杂交（dotblothybridization，DBH）技术、限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析以及一些新型检测技术。（一）核酸扩增技术1.常规PCR：通过PCR技术扩增23SrRNA基因，将检测菌株和MP标准菌株的PCR扩增产物进行测序，比对结果，以确定23SrRNA基因位点的基因型。该方法准确可靠，能检测所有可能的突变，但存在局限性，需外送测序，检测周期较长。2.实时PCR：实时PCR包括双重、单一及多重实时PCR，用于检测MP的23SrRNA基因中与大环内酯类耐药性相关的突变。通过实时PCR和高分辨率熔解分析检测MRMP，可以快速区别大环内酯类耐药株与敏感株。双重实时PCR可检测6种23SrRNA突变，但因A2062G和A2063G突变熔解温度接近，故开发了单一实时PCR专门检测A2063G突变。Nummi等

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设计了多重实时PCR，可同时检测MP、肺炎衣原体中大环内酯类耐药常见突变。Liu等

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设计了新型实时PCR，能检测2063和2064位点所有突变类型，且灵敏度高。基于锁核酸探针的实时PCR可区分突变与野生型菌株，能直接检测唾液样本

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。基于多重实时PCR，有研究建立了1种基于便携式即时检测（point-of-caretesting，POCT）系统的新型多重实时荧光定量PCR检测体系，可同时检测14种呼吸道病原体

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。Lightmix检测法基于定量PCR技术，能识别目标微生物的基因序列，检测和区分敏感与耐药菌株，可同时检测多个目标基因

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。等位基因特异性实时PCR（allele-specificreal-timePCR，AS-PCR）结合实时PCR和等位基因特异性PCR优点，通过荧光信号变化及熔解曲线分析检测突变，灵敏度高、省时。Guo等

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用染料AS-PCR检测A2063G和A2064G位点突变，灵敏度高，但染料法存在非特异性扩增。因此，建立探针AS-PCR可提高扩增特异性，根据循环阈值（cyclethreshold，Ct）直接判读结果。3.巢式PCR（nestedPCR，nPCR）：nPCR是一种高灵敏度、高特异性的PCR技术，通过两轮PCR扩增来检测目标基因。在MP耐药基因检测中，扩增23SrRNA基因，并将基因序列与MP标准菌株进行比较。该方法可以直接从临床标本中检测MP耐药基因。此外，Lin等

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开发了一种快速、价格低廉的方法，该方法结合了nPCR、单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphisms，SSCP）和毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE），可直接从咽拭子中检测大环内酯类耐药突变。基于此，Gu等

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利用PCR-CE研究了儿童MP流行病株的基因分型和耐药性，此方法无需分离培养，能直接从咽拭子样本检测耐药突变，降低操作复杂性；不过，该方法存在以下局限性：需要专业技术与设备，限制了其在资源有限环境中的应用；主要针对已知耐药突变，难以检测新的或未知突变；未测试与其他菌株的交叉反应。4.环介导探针裂解PCR（cycleavePCR）：cycleavePCR是一种结合了荧光标记和荧光猝灭剂标记的DNA/RNA寡核苷酸探针和核糖核酸酶H（RNaseH）的新方法。当探针与互补序列形成杂交时，RNaseH可以切割探针，导致强烈荧光发射。如果探针结合区域存在不匹配，则探针不会被切割。Liu等

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开发了具有1对引物和3个循环探针的cycleavePCR方法，该方法可以检测23SrRNA基因中携带A2063G或A2064G转换突变的大环内酯类敏感和耐药菌株。然而，cycleavePCR只能检测A2063G和A2064G突变。5.肽核酸介导的环介导等温扩增：Sakai等

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开发了基于肽核酸介导的环介导等温扩增检测方法，用于快速检测MP23SrRNA基因的单核苷酸点突变。该方法设计2个非重叠的荧光探针，能够有效检测23SrRNA基因中2063和2064位点的所有突变类型。检测结果依据ΔCt值判定：ΔCt<0.5表示对大环内酯类敏感，ΔCt>2.0表示耐药。该方法中肽核酸具有高亲和力，可以与互补的DNA序列形成稳定的双链结构，从而在环介导等温扩增反应中提供高度特异性的突变检测。检测在60min内可完成，适合POCT。但环介导等温扩增引物设计较为复杂，结合肽核酸后，多重反应难以实现。（二）基因测序技术PSQ用于快速检测MP耐药性，与常规方法一致性达100%。Spuesens等

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开发了4种针对23SrRNA基因、MPN141基因和MPN528a基因内序列的检测方法，其优势是速度快，虽可直接用于临床样品纯化的DNA，但测序前需通过PCR提高灵敏度。宏基因组二代测序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）作为高通量测序技术，有助于诊断混合感染或少见、罕见病原感染，可快速、高效确定病原体，可同时对样本中所有微生物的DNA进行测序，无需提前培养，能直接从临床样本提取DNA检测MP耐药基因位点，检测更快速，但技术成本较高

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。WGS技术借助高通量测序平台可全面分析MP基因组特征，能检测大环内酯类耐药相关的23SrRNA基因突变、氟喹诺酮类耐药相关的gyrA和parC基因突变等，有望发现未知耐药基因，以推动耐药机制研究，具有全面、精准的优势，不过该技术成本较高且分析复杂

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。（三）杂交技术1.RFLP技术：RFLP技术用于检测DNA序列的多态性。通过限制性内切酶对目标DNA片段进行切割，结合电泳分析，识别23SrRNA基因中与大环内酯类药物耐药相关的A2063G或A2064G突变。RFLP对突变等位基因的最低检测限为10%~20%，易漏检低丰度突变。2.DBH技术：DBH技术利于致病菌分子水平的快速鉴定及耐药突变检测。以往因依赖昂贵点样仪和扫描仪，限制了其应用范围。采用硝酸纤维膜、尼龙膜载体之后，结合地高辛标记、酶催化显色等，无需特殊仪器，简化了流程，拓宽了其应用范围。沈俊娅和范骏

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针对A2063G、A2063C和A2064G突变设计了引物和探针，以尼龙膜为载体，用地高辛标记和检测试剂盒检测标本，结果与测序一致，验证了此方法的可靠性。（四）新兴检测技术1.质谱技术：Zhao等

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建立了多重PCR结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）检测MP多位点单碱基突变（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和大环内酯类药物敏感基因检测方法。该方法的检测限为10

2~10

3拷贝/反应，可同时检测多个SNP位点，且结合多重PCR与MALDI-TOFMS，简化了实验流程，便于临床实验室应用。该方法也存在以下局限性：灵敏度受多重PCR检测下限制约，难以准确检测低丰度样本；对痰液等临床样本，需额外处理，以提高检测准确性

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39,40,41］

。2.成簇规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPRassociatedprotein，CRISPR-Cas）检测系统：CRISPR-Cas检测系统具有高特异性及灵敏性，且无复杂温度要求，降低了对检验设备和环境的要求，在分子检测领域潜力巨大

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。已有研究开发出巢式多重AS-PCR结合CRISPR/Cas12a的新方法，同时检测10个SNP，用利福平耐药的结核分枝杆菌做临床验证，检测限低至10

2

aM

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。CRISPR-Cas系统支持多重检测，设计sgRNA能同时检测多种耐药基因，提供更全面耐药信息。此外，有研究开发了滚环扩增（rollingcircleamplification，RCA）联合CRISPR-Cas12a技术的检测方法，该方法构建了基于RCA和CRISPR-Cas系统的多重SNP检测方法，靶标DNA识别SNP后，锁环探针成环，随后进行RCA扩增，CRISPR/Cas12a-gRNA-DNA形成三元复合物，激活反式切割活性后，切割荧光探针，区分是否发生SNP。该方法能够在单一反应管中并行检测多个耐药相关的SNP，操作简单

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。3.耐药基因检测系统：GENECUBE

®是基于微流控技