微生物正交实验

微生物学教研室种子的扩大培养第1页

菌种扩大培养是发酵生产第一道工序,该工序又称为种子制备。菌体数量增加种子制备高质量种子种子扩大培养任务：取得纯而壮且活力旺盛、接种数量足够培养物。

发酵时间长短和接种量大小相关。将较多数量成熟菌体接入发酵罐中，有利于缩短发酵时间，提升发酵罐利用率，降低染菌机会。第2页一、种子制备过程1、固体培养基上生产大量孢子孢子制备2、液体培养基中生产大量菌丝过程第3页1、孢子制备

孢子制备是种子制备开始，孢子质量、数量对以后菌丝生长、繁殖、发酵产量有显著影响。（1）放线菌孢子制备限制碳源、氮源（碳源1％，氮源不超出0.5％）；添加麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、无机盐；干燥。放线菌发酵生产工艺流程：菌种母斜面子斜面摇瓶种子

种子罐

发酵罐（孢子）（孢子）（菌丝）第4页（2）霉菌孢子制备普通以大米、小米、玉米、麸皮等天然农产品为培养基（3）细菌培养物制备斜面多为碳源限量、氮源丰富配方第5页2、种子制备种子制备是将固体培养基上培养出孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体过程。（1）摇瓶种子制备：一些孢子发芽和菌丝繁殖速度迟缓菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。分母瓶和子瓶。（2）种子罐种子制备：因菌种不一样而异，普通可分为一级种子、二级种子和三级种子制备。第6页A、一级种子：孢子或摇瓶菌丝被接入到体积较小种子罐中，经培养后形成大量菌丝。一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。B、二级种子：将一级种子转入体积较大种子罐中，经过培养形成更多菌丝。二级种子转入到发酵罐内发酵，称为三级发酵。C、三级种子，四级发酵种子罐级数主要决定于菌株性质和菌体生长速度及发酵设备合理应用。第7页二、种子培养表面培养法：好氧静置培养法固体培养法：曲法培养

液体深层培养液体表面培养固体表面培养浅盘固体培养深层固体培养第8页液体深层培养液体深层种子罐从罐底部通气，送入空气由搅拌浆叶分散成微小气泡以促进氧溶解。这种由罐底部通气搅拌培养方法，相对于气液界面靠自然扩散使氧溶解表面培养法，称为深层培养法。深层培养基本操作三个控制点：Ⅰ灭菌Ⅱ温度控制Ⅲ通气、搅拌第9页几个深层培养法（1）控制培养法：依据罐内部改变情况，掌握短时间内状态变量改变以及可能测定环境因子对微生物代谢活动影响，以此为基础作控制培养，以到达产物最优培养条件。（2）载体培养法：以天然或人工合成多孔材料代替麸皮之类固体基质作为微生物载体。（3）两步法：酶制剂两步深层培养中，将菌体生长（营养期）和产酶条件（繁殖期）区分开。第10页三、种子质量控制种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等原因影响。种子质量是发酵能否正常进行主要原因之一，因为种子制备不但是要提供一定数量菌体，更为主要是要为发酵生产提供适合发酵、含有一定生理状态大菌体。种子质量控制将以此为出发点。第11页三、种子质量控制1、培养基：尽可能选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长培养基；营养成份要尽可能和发酵培养基相近。2、培养条件：最适温度；通气搅拌控制。青霉素生产：通气充分和通气不足种子都接入发酵罐，发酵单位可相差一倍。土霉素发酵生产：一级种子罐通气量小却有利。搅拌不足会引发菌丝结团、菌丝粘壁等异常第12页3、种龄：即种子培养时间。普通选对数生长久，菌体量还未到达最高峰时移种。最适种龄：细菌——7～24h；霉菌——16～50h；放线菌——21～64h同一菌种不一样罐批培养相同时间，得到种子质量也不完全一致，所以最适种龄更应经过屡次试验，依据本批种子质量来确定。第13页4、接种量：即移入种子液体积和接种后培养液体积百分比。接种量大小与该菌在发酵罐中生长繁殖速度相关。

近年来，生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产办法，如谷氨酸生产：采取高生物素、大接种量、添加青霉素加大接种量双种法种子罐染菌或不理想倒种法、混种进罐第14页5、种子质量标准（1）细胞或菌体：菌体形态：显微镜观察

菌体健壮、菌形一致、均匀整齐（单细胞菌体种子）菌丝粗壮、对一些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝和内含物情况良好（霉菌和放线菌种子）菌体生长量：离心沉淀法、光密度法、物质代谢反应种子液外观：颜色、粘度。第15页（2）生化指标：种子液糖、氮、磷、和pH值改变（3）产物生成量：（4）酶活力5、种子质量标准第16页6、种子异常分析种子异常往往表现为：（1）菌种生长发育迟缓或过快：和孢子质量和种子罐培养条件相关。（2）菌丝结团：液体培养条件下，繁殖菌丝不分散舒展而聚集成团为菌丝团，与搅拌效果差、接种量小相关。（3）菌丝粘壁：与搅拌效果差、泡沫过多、种子罐装料系数过少等相关。第17页种子带菌及其防治：a种子带菌：发酵前期染菌主要原因之一，是发酵成败关键。b种子带菌原因：保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养基所包括设备和装置染菌等。第18页C种子染菌防治：

严格控制无菌室污染；制备种子时对沙土管、斜面、摇瓶等严格进行管理，防止杂菌进入而受到污染；对每一级种子培养物进行严格无菌检验；对菌种培养基或器具进行严格灭菌处理。

第19页工业培养基及制备第20页培养基

定义：提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要按一定百分比配制各种营养物质混合物。第21页一、工业培养基选择从微生物特点来选择培养基液体和固体培养基选择从生产实践和科学试验不一样要求选择从经济效益方面考虑选择生产原料第22页二、培养基配置标准依据不一样微生物营养需要配制不一样培养基营养成份恰当配比渗透压pH值氧化还原电位第23页三、工业发酵培养基

消耗每克底物将产生最大菌体得率或产物得率能产生最高产品或菌体浓度能得到产物最大速率副产品得率小价廉质量稳定起源丰富且供给充分第24页蚌埠丰原生化利用先进生物发酵和当代化工分离技术，以生物发酵技术为起点，大力发展农产品深加工产业，发展成为集生物化工、制药、食品加工、油脂加工、生物新材料为一体加工制造产业集团。

柠檬酸及其盐类产品生产能力处于全国发酵产品行业第一位，在世界同行业排名前列，位居全国精细化工之首。丰原生化以玉米、小麦、油料等农作物为原料，借助自己独创“利用玉米清液一次发酵生产柠檬酸”专利技术，国内首家开发利用,开辟了柠檬酸生产新路径，选育了适应该原料新菌株，缩短了发酵周期，提升了收率，总收率达80%以上。降低了成本，提升了产品质量，其综合经济技术指标处于国内领先水平。以玉米代替山芋干为原料，防止了环境污染，副产品还可开发利用。第25页1、工业惯用碳源2、工业惯用氮源3、无机盐4、生长因子5、前体物质和促进剂四、工业发酵培养基成份第26页工业惯用碳源功效：供给菌体生命活动所需能量组成菌体细胞以及代谢基础谷物淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麦酒精、简单有机酸、烷烃甲醇、甲烷第27页工业惯用氮源

功效：组成菌体细胞物质和代谢产物无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐等有机氮源：玉米浆、豆饼粉、鱼粉、酵母浸出液等

第28页无机盐硫酸盐、磷酸盐、氯化物、含钾、钙、钠、镁、铁化合物微量元素：铜、锰、锌、钼等功效：组成菌体成份、酶组成部分、酶激活剂或抑制剂、调整培养渗透压、调整pH和氧化还原电位第29页生长因子定义：凡是微生物生长不可缺乏微量有机物质，如：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素（生物素、硫胺素）。功效：组成细胞组成，促进生命活动进行。并非必需。提供生长因子农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜、酵母第30页谷氨酸产生菌：生物素缺点型生物素对菌体和谷氨酸积累都有影响发酵中添加“亚适量”浓度第31页前体物质目标：有利于调整产物形成，大幅度提升发酵产率、降低成本。丝氨酸前体甘氨酸色氨酸前体吲哚/氨茴酸前体直接被菌体在微生物合成过程中结合到产物分子上，而其本身结构并没有多大改变，产物产量大幅度提升。第32页促进剂

定义：在氨基酸、抗生素、酶制剂发酵生产过程中，可在发酵培养基中加入一些对发酵起一定促进作用物质，称为促进剂。比如：酶制剂发酵过程，添加诱导物、表面活性剂等促进剂。第33页总之，培养基配置可参考前人经验配方，再结合菌种和产品特征，采取摇瓶等小发酵设备对碳、氮、无机因子等单因子逐一试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成影响，再综合考虑各原因影响，以得到最优配方。为降低试验次数，可考虑用“正交试验设计”等方法确定培养基组分和浓度。第34页正交试验法定义：用正交表安排多原因试验与分析试验结果方法，简称正交试验。原因：影响试验指标条件水平：原因所处状态第35页简化试验次数诸原因中哪些原因对指标影响较大，哪些原因较小。所考查原因各取什么水平能使试验指标很好指标在不一样水平时改变规律等正交试验意义第36页惯用正交表比如：

L4（23），L16（44），L27（313）正交表格式：Ln（tq）L代表正交表，n代表试验次数，t代表原因水平数，q代表原因数。

惯用正交表可查阅相关统计学书籍直接套用。第37页正交表选择依据：在能容纳所研究原因数和原因水平数前提下选取试验次数最少正交表来安排试验正交表安排试验注意事项：尽可能使各原因水平数相等，试验重复次数相当。第38页正交设计试验结果分析

直观分析

方差分析第39页直观分析

K1：每一原因每一水平下试验指标值总和k1：每一原因每一水平下试验指标值平均数R（级差）：试验指标随原因水平改变而改变最大范围第40页正交设计表表头设计

考查指标：糖酸转化率（％）第41页

L16(44)正交实验

第42页正交试验结果直观分析第43页实验结果分析各原因对产酸影响大小次序为：葡萄糖>KH2PO4>尿素>玉米浆，各原因水平为：A2，B3，C2，D3由此最终确立了菌株优化配方：葡萄糖4％；尿素1.5％；玉米浆1％；KH2PO40.5％。第44页直观分析优点：简便、计算工作量小直观分析缺点：判断原因效应精度不够，也不能给出误差大小。第45页正交试验结果方差分析考查指标：糖酸转化率（％）第46页L16(44)正交试验结果

第47页试验结果方差分析第48页

以n表示试验总次数，t代表A、B、C、D四原因每个水平重复试验次数。n＝16，t＝4，方差分析平方和QA＝（∑Ki2）/t－（∑Xi）2/n＝111818/4－6362/16＝2673.5QB＝19182/4－6362/16＝14.5QC＝101258/4－6362/16＝33.5QD＝101550/4－6362/16=106.5

Q＝∑Xi2－（∑Xi）2/n＝28137.6－6362/16＝2856.4

Qe＝Q－(QA+QB+QC+QD)＝28.4第49页F＝s12/s22F检验法经过计算方差之比来检验两组数据是否存在显著性差异F（f1，f2）0.05＝9.28F（f1，f2）0.01＝29.46

第50页当F>F（f1，f2）0.05时，该处理引发差异有显著意义；当F>F（f1，f2）0.01时，该处理引发差异有非常显著意义；当F<F（f1，f2）0.05时，该处理引发差异有没有显著意义查单侧F分布表第51页依据F检验能够看出原因A非常显著，方差分析观点认为，只需对显著原因进行选择，不显著原因标准上可选试验范围内任一点。所以可选A2，原因B、C、D可在试验范围内任取一点或由其它指标确定。第52页微生物发酵方法第53页发酵方法好氧发酵厌氧发酵：液体表面发酵固体表面发酵通氧深层发酵不通氧深层发酵第54页不论好氧或厌氧发酵都可经过深层培养来实现，这种培养均在含有一定径高比圆柱形发酵罐内完成，操作方法可分为一下五种：分批式操作半分批式操作（流加式操作）重复分批式操作重复半分批式操作连续式操作第55页深层发酵操作方法（一）分批发酵（二）补料分批发酵法（三）连续发酵法1、开放式连续发酵2、封闭式连续发酵第56页（一）分批发酵

（batchfermentation)每一批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。发酵工业常见单罐深层分批发酵特点：微生物所处环境是不停改变，可进行少许多品种发酵生产，发生杂菌污染能够很轻易终止操作，当运转条件发生改变或需要生产新品种时，易改变处理对策，对原料组成要求粗放。第57页迟缓期对数期稳定时衰亡期第58页（二）补料分批发酵法

(fed-batchfermentation)补料分批发酵法又称半连续发酵或半连续培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基培养方法。补料分批发酵法广泛适合用于抗生素、氨基酸、酶制剂、有机酸、高聚物等生产。与分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低基质浓度低基质浓度优点①能够除去快速利用碳源阻遏效应，并维持适当菌体浓度，不致加剧供氧矛盾②防止培养基积累有毒代谢物第59页（三）连续发酵法

(continuousfermentation)

当微生物培养到对数生长久时，在发酵罐中首先以一定速度连续不停地流加新鲜液体培养基，另首先又以一样地速度连续不停地将发酵液排出，使发酵罐中微生物生长和代谢活动一直保持旺盛稳定状态，而pH值、温度、营养成份浓度、溶解氧等都保持一定，并从系统外部给予调整，使菌体维持在恒定生长速度下进行连续生长和发酵，大大提升发酵生长久有效率和设备利用率。第60页连续发酵类型1、开放式连续发酵：培养系统中微生物细胞伴随发酵液流出而一起流出，细胞流出速度等于新细胞生成速度。可使细胞浓度处于某种稳定状态。最终流出发酵液如部分返回（反馈）发酵罐进行重复使用，则该装置叫做循环系统，发酵液不重复使用装置叫做不循环系统。第61页（1）单罐均匀混合连续发酵：培养液以一定流速不停地流加到带机械搅拌发酵罐中，与罐内发酵液充分混合，同时带有细胞和产物发酵液又以一样流速连续流出。假如用一个装置将流出发酵液中部分细胞返回发酵罐，则组成循环系统

单罐连续发酵1－发酵罐2－分离器第62页（2）多罐均匀混合连续发酵将若干搅拌发酵罐串连起来，就组成多罐均匀混合连续发酵装置。新鲜培养液不停流入第一次发酵罐，在最终一只罐中流出。多级连续发酵能够在每个罐中控制不一样环境条件以满足微生物生长各阶段不一样需要，并能使培养液中营养成份得到较充分地利用，最终流出发