CN113227374A 用于免疫疗法的组合物和方法 （因特利亚治疗公司）

PCT/US2019/05639920WO2020/081613EN2020.04.提供了用于在TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因2i.包括表1和/或表3中任一个列出的SEQIDNO：1_89和179_184的基因组坐标的15个349.一种改变TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因内的DN10.一种降低TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的表达的方法，包括向细胞递送第一导向512.一种通过在TRAC基因座处基因座内插入来表达异源免疫受体的方法，包括向细胞递送第一导向RNA、第二导向RNA和RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向的DNA结合剂的核14.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述第一导向RNA包括SEQID15.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述第一导向RNA包括SEQIDNO：617.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中所述第一导向RNA、所述第二导向RNA和所述RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向的DNA结合剂的核酸基本上同时施用。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中引入RNA导向的DNA结合剂或编码者者21.根据权利要求1_20中任一项所述的方法，进一步包括引入编码目的多肽的核酸序f.所述一种或多种目的多肽包括WT1特异性嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体识序列，和7序列，和续子序列，h.引入包括编码(e)或(f)的第二TCR序列的序列的23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第一核酸序列的侧翼是与第一靶基因座同24.根据权利要求22所述的方法，其中所述第二核酸序列的侧翼是与第二靶基因座同25.根据权利要求23_24中任一项所述的方法，其中所述第一靶基因座是所述TRAC、26.根据权利要求24_25中任一项所述的方法，其中所述第二靶基因座是所述TRAC、28.根据权利要求22_27中任一项所述的方法，29.根据权利要求22_27中任一项所述的方法，830.根据权利要求22_29中任一项所述的方法32.一种基因座内插入TCR(诸如WT1特异性TCR)的方法，包括向细胞递送(i)用于插入b.RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向的37.根据权利要求36所述的组合物，用于改变细胞中TRBC1和/或TRBC2基因内的DNA序38.根据权利要求36或权利要求37所述的组合物，939.根据权利要求36_38中任一项所述的组合物，其中b.RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向的43.根据权利要求40_42中任一项所述的组合物，其中所述导向RNA44.一种通过权利要求1_43中任一项所48.根据权利要求44_47中任一项所述的细胞，其中所述细50.根据权利要求44_48中任一项所述的细胞，其缺乏内源T细胞受体，用于制备表达53.根据权利要求44_52中任一项所述的细胞c.所述一种或多种目的多肽包括T细胞受体，进一步任选地其中所述T细胞受体对WT156.根据权利要求44_55中任一项所述的细胞，其另外包括编码外源T细胞受体的γ链57.根据权利要求56所述的细胞，其中编码58.根据权利要求54_57中任一项所述的细胞，其中所59.根据权利要求54_58中任一项所述的细胞，其中所述TCRα链由根据SEQIDNO：60.根据权利要求54_59中任一项所述的细胞，其中所述TC62.根据权利要求44至61中任一项所述的细胞，其中所述一个或多个基因由内源启动63.根据权利要求44至62中任一项所述的细胞，其中所述一个或多个基因由异源启动64.一种细胞的群体，其包括根据权利要求44_63中任一项所述的细胞，其中大于约____68.一种细胞的群体，其包括根据权利要求44_63中任一项所述的细胞，其中大于约72.一种细胞的群体，其包括根据权利要求44_中所述TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的表达相对于同一细胞的未改变的群体降低了至少约73.根据权利要求72所述的群体，其中所述TRBC1、TRBC2和74.根据权利要求72所述的群体，其中所述TRBC1、TRBC2和75.根据权利要求72所述的群体，其中所述TRBC1、TRBC2和76.根据权利要求64_75中任一项所述的群体，其中所述减少是在所述TRBC1基因的表77.根据权利要求64_76中任一项所述的群体，其中所述减少是在所述TRBC2基因的表78.根据权利要求64_77中任一项所述的群体，79.一种细胞的群体，其包括根据权利要求44_78中任一项所述的细胞，其中10％至81.根据权利要求76或79所述的群体，其中所述插入缺失或插入位于所述TRBC1基因82.根据权利要求77或79所述的群体，其中所述插入缺失或插入位于所述TRBC2基因84.根据权利要求1至4或9至43中任一项所述85.根据权利要求4_43中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述组合物导86.根据权利要求9_43中任一项所述的方法或用于使用的组合物，其中所述组合物导87.根据权利要求79_86中任一项所述的方法或用88.根据权利要求84_87中任一项所述的方法或89.根据权利要求4_43中任一项所述的方法或组合物90.根据权利要求4_43中任一项所述的方法或组合物91.根据权利要求1_43中任一项所述的方法或组合物，其中所述靶序列位于所述92.根据权利要求91所述的方法或组合物，其中所述靶序列位93.根据权利要求91所述的方法或组合物，其中所述靶序列位94.根据权利要求91所述的方法或组合物，其中所述靶序列位95.根据权利要求91所述的方法或组合物，其中所述靶序列位97.根据权利要求1_43中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向序列与TRBC1、98.根据权利要求1_43中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向序列与所述99.根据权利要求1_43和84_98中任一项所述的方法或组然或非天然核苷酸，其中所述N形成所述导向序列，并且所述导向序列将Cas9靶向至所述105.根据权利要求1_43和84_104中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向RNA被108.根据权利要求1_43和84_107中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向RNA包109.根据权利要求108所述的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包含29_O_甲基118.根据权利要求108_117中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向RNA包括SEQ119.根据权利要求108_118中任一项所述的方法或组合物，其中所述组合物进一步包121.根据权利要求1_43和84_120中任一项所述的方法或组合物，其中所述导向RNA和123.根据权利要求121或122所述的方法或组合物，其中所述RNA导向的DNA结合剂是124.根据权利要求123所述的方法或组合物，其中所述RNA导向的DNA结合剂是Cas9蛋134.一种治疗人或动物的方法，包括施用根据权利要求36_125中任一项所述的组合137.一种治疗人或动物中过表达维尔姆斯瘤抗原(WT1)的肿瘤的方法，包括施用根据[0001]本申请要求2018年10月16日提交的美国临时专利申请第62/746,522号和2018年[0002]本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表，该序列表通过引用全部并入[0003]CRISPR(聚集的规则间隔的短回文重复序列)在细菌中进化为一种适应性免疫系序列的该RNA介导Cas9蛋白靶向病毒基因组中的序列。Cas9蛋白切割，并且从而限制病毒裂(SSB)或双链断裂(DSB)的引入允许通过例如非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复期靶的活性低于预期的T细胞(包含但不限于产生表达来自TRAC基因座的CAR和可以与CAR具有RNA导向的DNA结合剂的导向RNA(诸如CRISPR/Cas系统)以大幅减少或敲除TRBC和/或改造以插入目的编码序列的T细胞，例如被进一步工程改造以表达T细胞受体(诸如经修饰[0026]本发明另外还提供了一种降低TRBC1和/或TRBC2基因的表达的方法，包括向细胞[0078]本发明另外还提供了一种改变TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因内的D包括向细胞递送第一导向RNA、第二导向RNA和任选的RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向生更大的IFN_γ分泌(例如响应于诱导肽(例如维尔姆斯瘤基因(WT1)抗原))方面是有利敲除突变体在产生比TRAC单敲除突变体更低程[0124]本发明另外提供了一种通过在TRAC基因座的基因座内插入来表达异源免疫受体[0144]作为修饰方法的一部分，可以引入或施用RNA导向的DNA结合剂或编码RNA导向的[0146](a)在细胞和/或受试者中的TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因[0147](b)在细胞和/或受试者中的TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因[0152](c)所述一种或多种目的多肽包括T细胞受体，进一步任选地其中所述T细胞受体[0154](e)所述一种或多种目的多肽包括嵌合抗原受体，进一步任选地其中所述嵌合抗[0182]引入的核酸序列或第一核酸序列和第二核酸序列可以在没有启动子区域的情况[0186]本发明还提供了一种基因座内插入TCR(诸如WT1特异性TCR)的方法，包括向细胞[0215]该组合物可以用于改变细胞中TRAC基因内的DNA序列。该组合物可以用于降低[0218]细胞可能缺乏内源T细胞受体。该细胞可能适合于制备表达非内源T细胞受体的T[0223](c)所述一种或多种目的多肽包括T细胞受体，进一步任选地其中所述T细胞受体[0224](d)所述一种或多种目的多肽包括嵌合抗原受体，进一步任选地其中所述嵌合抗[0240]10％至100％的细胞的群体(例如30％至99％的群体)可以在TRBC1、TRBC2和/或[0242]插入缺失或插入可以位于TRBC1基因中。插入缺失或插入可以位于TRBC2基[0243]本文所述的方法或用于使用的组合物可以导致TRBC1和/或TRBC2基因的编辑。本[0256]靶序列可以位于TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的外显子1中。靶序列可以位于[0258]所述第一导向序列可以与TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的正链中的第一靶序列互[0259]导向RNA可以包括选自SEQIDNO1_178中任一个的导向序列，并且进一步包括[0260]导向RNA可以包括选自SEQIDNO1_178中任一个的导向序列，并且进一步包括[0262]第一导向RNA可以包括SEQIDNO：2的序列，并且第二导向RNA可以包括SEQID4_双(辛氧基)丁酰基)氧基)_2_((((3_(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八[0290]所述组合物可以进一步包括RNA导向的DNA结合剂。导向RNA和RNA导向的DNA结合[0304]本发明还提供了在治疗人或动物中过表达维尔姆斯瘤抗原(WT1)的肿瘤的方法中[0307]还公开了其中导向序列选自在改变的产物中产生分别为20％或更高、30％或更[0308]还公开了其中导向序列选自在改变的产物中产生分别为20％或更高、30％或更靶向结构域互补的靶序列的基因和任选地包含与第二gRNA分子的靶向结构域互补的靶序列的基因的功能产物的表达，和/或包含与第三gRNA分子的靶向结构域互补的靶序列的基的免疫疗法被归类为活化免疫疗法。基于细胞的免疫疗法已被证明可有效地治疗一些癌[0323]图7A_B示出了TRBC、TRAC和对照导向物(SEQIDNO：193和194)的[0325]图9A_D示出了具有TCR插入的T细胞杀死原代AML原始细胞的能力。图9A至9C示出了用从3个携带HLA_A*02:01等位基因的不同患者获得的原代AML原始细胞获得的结果。图[0326]图10示出了通过使用多个双导向RNA同时编辑TRAC和TRBC基因座获得的编辑频[0328]图12A_B示出了通过使用多个单导向RNA同时编辑TRAC和TRBC基因座获得的编辑__[0329]图13A_B示出了在采用双RNA导向物和具有带间隙插入模板的AAV载体(AV9)的TRAC基因座处GFP插入的程度(图13A)，以及采用这些为CD3_的双RNA导向物和AAV载体的[0330]图14A_14B示出了使用sgRNA和间隙模板AV9在TRAC基因座处GFP插入的程度(图[0331]图15A_B比较了在FACS分析期间如通过阳性四聚体染色(图15A)和平均荧光强度[0332]图16A_C示出了在通过在TRAC基因座处具有无启动子GFP构建体的AAV插入的插入[0333]图17A_C示出了在TRAC基因座处具有和不具有启动子序列的TCR构建体模板的插[0337]图21A_B测量了插入的构建体的TCR链与内源TCR链之间的错配程度，如通过流式细胞术测量的。图21A和图21B的FACS数据描述了表达转基因或错配的TCR的工程改造的细胞的部分，并且图21A和图21B的工程改造的细胞中的TCR表达的强度分别在图21C和图21D[0338]图22测量了插入的构建体的TCR链与CD8+或CD4+细胞中的内源TCR链之间的错配[0339]图23示出了具有和不具有TRBC敲除的四种不同版本TCR的VLD(维尔姆斯瘤抗原)[0340]图24示出了具有和不具有TRBC敲除的四种不同TCR的VLD(维尔姆斯瘤抗原)四聚是通过测量6小时后响应于半胱氨酸蛋白酶3/7凋亡细CRISPRRNA)，或crRNA和trRNA的组合(也被称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可以作为单个些实施例中，导向序列与其相应的靶序列之间的互补性或同一性的程度可以是约75％、[0360]RNA导向的DNA结合剂的靶序列同时包含基因组DNA的正链和负链(即给出的序列Zetsche，表S1和表S3。参见，例如，Makarovaetal.《自然微生物综述(NatRev[0363]如本文所使用的，如果第一序列与第二序列的比对示出了第二序列的全部X％或的交换，或者反之亦然)以及核苷类似物(诸如修饰的尿苷)的存在不会导致多核苷酸之间认设置的Needleman_Wunsch测量mRNA的敲低的方法是已知的，并且包含对从目的组织或细胞群体分离的mRNA进行测[0380]本文提供了可用于改变TRBC和/或TRAC基因内的DNA序列，例如诱导单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)的组合物，例如使用具有RNA导向的DNA结合剂的导向RNA(例如列的基因组坐标的15个连续核苷酸±10个核3/末端之后在5/至3/方向上具有以下示例性的核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU向上包括以下示例性的核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA括包括有表1_3所示的导向序列的crRNA。gRNA可以包括包括有表1和2所示的导向序列的例如表1和2所示的导向序列。第一RNA分子和第二RNA分子可以不是共价连接的，但可以通过crRNA和trRNA的部分之间的碱基配对形成RNA双链体。[0403]在本文所述的每个实施例中，导向RNA可以包括单个RNA分子作为“单个导向RNA”[0404]在一些实施例中，trRNA可以包括源自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分[0407]在一个方面中，本发明提供了一种包括gRNA的组合物，所述gRNA包括与SEQID[0409]本发明的导向RNA组合物被设计为识别TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因中的靶序列DSB的结果而发生的插入缺失导致的移码突变)可能比基因的其他区域中的突变更不耐受，因此DSB的位置是可能导致的蛋白质敲低的量或类型的重要因素。在一些实施例中，与TRBC1、TRBC2和/或TRAC内的靶序列互补或与其具有互补性的gRNA用于将RNA导向的DNA结计为具有与TRBC1和/或TRBC2的外显子1、外显子2、外显子3或外显子4中的靶序列和/或使用或施用包括编码RNA导向的DNA结合剂(诸如Cas核酸接磷酸氧基和/或一个或多个连接磷酸氧基中的一种或两种的改变(例如替换)(示例性的[0416]化学修饰(诸如上面所列的化学修饰)可以被组合以提供修饰的gRNA和/或mRNA[0418]未修饰的核酸可能易于被例如细胞内核酸酶或在血清中发现的那些核酸酶降主链的主链修饰可以包含导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷的接头的[0420]修饰的磷酸基团的示例包含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸酯(borano的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替换桥连氧(即连接磷酸酯和核苷的氧)来修荷的磷酸基团可以被中性部分替换。可以替换磷酸基团的部分的示例可以包含但不限于，[0423]修饰的核苷和修饰的核苷酸可以包含对糖基团的一个或多个修饰，即在糖修饰2CH2NH)nCH2CH2氨基(其中[0427]本文所述的修饰的核苷和修饰的核苷酸(其可以被掺入到修饰的核酸中)可以包用以其整体并入)中公开的修饰模式之一。在一些实施例中，本文公开的导向RNA包括CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGm[0444]无碱基核苷酸是指缺乏含氮碱基的核苷酸。下图描述了具有缺乏碱基的无碱基码RNA导向的DNA结合剂(诸如如本文所述的Cas核酸酶)的开放阅读框(ORF)。在一些实施例(11)：E2106E2115。大多数内源性高等真核mRNA(包含哺乳动物m[0457]可以以共转录方式包含帽。例如，ARCA(抗反向帽类似物；ThermoFisher甲基鸟嘌呤3/甲氧基5/三磷酸，该鸟嘌呤核糖核苷酸可以在起始时在体外掺入到转录的mRNA的合成及性质(SynthesisandpropertiesofmRNAscontainingthenovel/antireverse/capanalogs7methyl(3/Omethyl)GpppGand7methyl(3/deoxy)7133)可以用于以共转录的防守提供Cap1结构。3′_O_甲基化版本的CleanCapTMAG和CleanCapTMGG也可从TriLinkBiotechnologies分别以目录号N_7413和N_7433获得。Biolabs目录号M2080S)，并且具有由其D1亚单位提供的RNA三磷酸酶和鸟苷酸转移酶活性种导向序列或来自表3的一种或多种sgRNA。在一些实施例中，RNA导向的DNA结合剂(例如[0466]在一些实施例中，Cas核酸酶是来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例奈瑟球菌的Cas9核酸酶。在一些实施例中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸[0467]在一些实施例中，gRNA与RNA导向的DNA结合剂一起被称为核糖核蛋白复合物[0472]在一些实施例中，RNA导向的DNA结合剂被修饰成仅含有一个功能核酸酶结[0473]在一些实施例中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性的氨基酸取代包含D10A(基于化脓性链球菌E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB_A0Q7Q2[0477]在一些实施例中，异源功能结构域可以促进RNA导向的DNA结合剂运输到细胞核RNA导向的DNA结合剂可以不与NLS融合。在一些实施例中，NLS可以是单部分序列，诸如，是荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性示例包含绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP_2、饰或影响靶序列。在一些实施例中，效应结构域可以选自核酸结合结构域、核酸酶结构域 “将CRISPR重新用作RNA导向的平台，用于基因表达的序列特异性控制(RepurposingCRISPRasanRNA_guidedplatformforsequence_specificcontrolofgene的转录因子的RNA导向的基因激活(RNA_guidedgeneactivationbyCRISPR_Cas9_based于靶特异性筛选的CAS9转录激活物和用于协同基因组工程改造的配对切口酶(CAS9transcriptionalactivatorsfortargetspecificityscreeningandpairednickasesforcooperativ节(CRISPR_mediatedmodularRNA_guidedregulationoftranscriptionin[0483]在一些实施例中，gRNA的功效是在与形成RNP的其他组分一起递送或表达时确定些实施例中，gRNA被递送至已经稳定地表达RNA导向的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶或切口被递送到作为RNP的一部分的细胞。在一些实施例中，gRNA连同编码RNA导向的DNA核酸酶型中(例如，在T细胞中)发生缺失或插入的非靶位点的数量是通过例如分析来自在体外用[0486]在一些实施例中，特定gRNA的功效通过gRNA选择过程的多个体外细胞模型来确一些实施例中，导向RNA的功效通过TRBC或TRAC的插入缺失百分比来测量。在一些实施例[0488]在一些实施例中，导向RNA的功效通过T细胞受体(TCR)的组分的减少的或消除的群体中以非常低的频率(例如5％)和/或相对于靶位点处的插入缺失产生的频率在非靶个非靶位点处产生插入缺失的导向RNA，例如，如通过本文所述的一种或多种方法所评估[0491]在一些实施例中，导向RNA的功效通过包括基因的表达蛋白产物的功能蛋白复合[0494]在一些实施例中，包括表1和2的导向序列以及RNA导向的DNA核酸酶诸如Cas核酸[0496]在一些实施例中，提供了包括表1和2中的任一个或多个导向序列或来自表3中的[0498]在一些实施例中，单次施用包括本文提供的导向RNA的组合物足以敲低TRBC1、[0500]脂质纳米颗粒(LNP)是递送核苷酸和蛋白质货物的有用手段，并且可以用于递送[0501]导向RNA或其他核酸(例如编码多肽)可以与脂质纳米颗粒(LNP)缔合。合适的LNP[0502]在一些实施例中，本发明包括用于将本文公开的任一种gRNA递送至受试者的方[0505]在一些实施例中，与本文公开的gRNA缔合LNP用于制备用于治疗疾病或障碍的药[0508]在一些实施例中，本文所述的导向RNA组合物(单独或编码在一种或多种载体上)些实施例中，载体包括一个或多个编码sgRNA的核苷酸序列和编码RNA导向的DNA核酸酶的trRNA或crRNA和trRNA或由crRNA、trRNA或crRNA和trRNA组成的核酸可以进一步包括载体复合的核酸被引入，或者它们可以作为核酸(例如gRNA)和蛋白质(作为核糖核蛋白复合物[0511]多肽可以通过递送核酸(诸如编码细胞的目的多肽的核酸模板)被引入到细这种侧翼序列任选地是同源臂，其被设计成促进同源定向修复和模板核酸在细胞中的整合。核酸模板可以包含目的多肽的开放阅读框(ORF)，其侧翼是与第一靶基因座同源的序靶基因座的区域，以产生该区域的缺失，其因此防止修复后切割位点，并且还防止gRNA/目的蛋白质序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)”和Dunbaretal.，“ANARCI：抗原受体编号和受体分类(ANARCI：antigenreceptornumberingand并且根据特定残基或残基组或者甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现被供多链受体(例如T细胞受体)的编码序列并且期望使用单个启动子(无论是内源的还是异[0537]实施例002.一种降低TRBC1和/或TRBC2[0627]实施例012.根据实施例11所述的组合物，用于[0628]实施例013.根据实施例11所述的组合物，用于降[0644]实施例022.根据实施例18_21中任一项所者者[0651]实施例026.根据实施例4_10和14_17中任一项所述的方法或用于使用的组合物，[0653]实施例028.根据实施例25_27中任一[0654]实施例029.根据实施例25_28中任一项所述的[0655]实施例030.根据实施例25_29中任一项所述[0665]实施例033.根据实施例1_17和24_32[0670]实施例038.根据实施例33_37中任一项[0671]实施例039.根据实施例1_17或24_38[0672]实施例040.根据实施例1_17或24_3[0673]实施例041.根据实施例1_17或24_40中组合物进一步包括与所述TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的负链中的第二靶序列互补的第二[0674]实施例042.根据实施例1_17或24_41[0675]实施例043.根据实施例1_17或24_4[0676]实施例044.根据实施例1_17或24_4任何天然或非天然核苷酸，其中N形成导向序列，并且所述导向序列将Cas9靶向至所述[0679]实施例047.根据实施例1_17或24_4[0690]实施例058.根据实施例1_17或24_5[0691]实施例059.根据实施例1_58中任一项所述的方[0692]实施例060.根据实施例59所[0700]实施例068.根据实施例1_17或24_6[0701]实施例069.根据实施例1_17或24_[0882]实施例250.根据任何前述实施例所述的组合物、制剂或细胞在制备药物中的用[0886]实施例254.根据实施例18_23中任一项[0887]实施例255.根据实施例18_23中任__所述群体中所述TRBC1、TRBC2和/或TRAC基因的表达相对于相同细胞的未改变的群体降低[0900]实施例268.根据实施例264_267中任一项所述的群体，其中所述减少位于所述[0901]实施例269.根据实施例264_267中任一项所述的群体，其中所述减少位于所述[0902]实施例270.根据实施例264_267中任一项所述的群体，其中所述减少位于所述[0904]实施例272.根据实施例271所述的群体[0905]实施例273.根据实施例271或272所述的[0906]实施例274.根据实施例271或272所述的群体[0915]转染24小时后收获HEK293_Cas9转染的细胞。根据制造商的方案，使用50μL/孔[0922]使用人参考基因组(例如hg38)和用户定义的目的基因组区域(例如TRAC蛋白编码[0923]针对靶向蛋白外显子编码区和内含子1的TRAC(ENSG00000277734)设计了总共88[0924]在HEK293_Cas9细胞中筛选了导向物的编辑效率。在补充有10％胎牛血清的DMEM[0929]对来自实例2的HEK293_Cas9细胞中具有最高插入缺失百分比编辑的24个导向物地靶向癌细胞且免疫原性较低。本实例描述了用于在T细胞中递送Cas9RNP(例如，Cas9[0931]T细胞可以商业获得(例如，冷冻人外周血CD4+CD45RA+T细胞，StemCell冲液、2巯基乙醇和任选的IL2)中加入3∶1比率的CD3/CD28珠(免疫磁珠，LifeTechnologies)进行活化。通过经由将等量的试剂混合并且在95℃下孵育2min并冷却至室代细胞96孔NucleofectorTM试剂盒(Lonza，目录号V4SP_3960)使用制造商的AmaxaTM96孔[0936]在细胞核转染4天后测量TCR的表达。使用可固定的活死染料(Thermofisher[0941]编辑人TRBC1(ENSG00000211751)和TRBC2(ENSG00000211772)的初始导向物选择例1所述进行DNA分离和NGS分析。图4A和4B以及表8示出了在HEK293_Cas9细胞中通过这些[0948]对来自实例4的HEK293_Cas9细胞中具有高插入缺失百分比编辑的TRBC导向物进行了人CD3+T细胞中编辑效率和T细胞受体(TCR)表达的筛选。如实例3所述进行细胞核转使用分离的HEK293_Cas基因组DNA筛选了7个靶向人TRAC的sgRNA、6个靶向TRBC的sgRNA和两个具有己知非靶概况的对照导向物。在生化测定中使用16nM的RNP浓度检测到的潜在非大量潜在的非靶位点，以便为可以在其他环境中(例如在目的原代细胞中)验证的潜在位点了不含细胞环境的纯化的高分子量基因组DNA，并且通过这些方法鉴定的潜在非靶位点可以使用鉴定的潜在非靶位点的靶向测序来验证。[0961]利用该测定测试了示出靶插入缺失活性的导向物的潜在的非靶基因组切割位在本实验中，使用从混合的雄性人外周血单核细胞(PBMC)纯化的基因组DNA连同具有已知3个靶向人TRAC的导向物。在图7B和表12中示出了在生化测定中使用64nM的导向物浓度检[0965]还测试了同时编辑TRAC和TRBC基因座的导向物。使用LymphoprepTM(StemCell浓度接种到补充有5％的FBS以及IL7和IL15(各5ng/ml胞术评价不含CD3分子的T细胞的百分比来评估第7天的TRAC和TRBC敲除效率，如图8A和表过45％的T细胞表达CD3分子(平均值±SEM＝45,3+5,7)。通过测量Dextramer阳性评估的和95时，通过测量Dextramer阳性评估的WT1特异性CD8+T细胞的百分比大于95％(平均值[0983]测试了具有TRAC和TRBC编辑以及LVHD1_TCR插入的T细胞杀死原代AML原始细胞[0987]还测试了同时编辑TRAC和TRBC基因座的另外的crRNA。用含有S过经由流式细胞术评价不含CD3分子的T细胞的百分比来评估TRAC和TRBC敲除效率，如图试剂盒(StemCellTechnology，目录号17951)进行阴性选择，来分离T细胞。T细胞在充有200U/mL的IL2(Peprotech)和各5ng/mL的IL7和IL15的基础培养基(补充有2_巯基乙[1007]包括Cas9蛋白和ggRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物通过混合等量的试剂并在95℃下孵育2min并冷却至室温来首先对单独的crRNA和trRNA进行预退火而生成。RNP中的导向物利用了作为单个RNA分子(单个导向RNA，sgRNA)或两个单独的RNA分子(双导向RNA，电穿孔，T细胞以5_20x106个细胞/100uL悬浮，其中按照指示添加TRAC和TRACRNP至2μMLonza4D_NucleofectorX单元(目录号：AAF_1002X)(使用P3缓冲液和制造商的脉冲代中的1ml细胞因子培养基中的1x10^6个细胞和相当于MOI3x10^5的病毒转移到该孔中。在[1010]RNP细胞核转染4至12天后，在96孔圆形底板中收集经编辑的T细胞(200ul/200,[1011]还测试了单个导向物在刺激的T细胞中在TRAC和TRBC基因座处的单独和同时编TRBC导向物的单独和同时编辑的敲低效率。不含CD3分子的T细胞的百分比在表21和图12A[1015]在CD3_T细胞中对TRAC和TRBC进行单独和组合编辑后，通过NGS分析来评估插入[1020]使用12个靶向TRAC基因座的导向物的位置来设计腺病毒相关病毒(AAV)模板，该向物的RNP以一式两份对T细胞进行细胞核转染，除了仅AAV和没有用作对照的RNP(空白对[1027]然后在T细胞中筛选靶向TRAC基因座的外显子1的单个导向物，以使用AV9评估插[1028]通过流式细胞术检测来自插入的构建体的GFP的荧光，来测定TRAC导向物的插入化学修饰的和未修饰的导向物的编辑效率并+的存在来评估T细胞特性并且通过TCR的特异性配体RMF肽的四聚体来评估表达插入的TCR胞的百分比在表25和图15A中示出。四聚体染色的T细胞的平均荧光强度(MFI)在表25和图启动子)的AAV模板(AV10)插入到TRAC基因座的外显子1中以确定内源TRAC启动子是否可以用AAVAV10对其进行转导。对照条件包含未编辑的T细胞(空白对照)和接受RNP细胞核转染CD3_%GFP+%97.576.41.90.80.00.0流式细胞术来检测表达插入的TCR的T细胞，如表27和图17A_C所示(TCR_A的抗_Vbeta8，[Biolegend目录号140104]，图17B中的TCR_D的Vbeta7.2[BeckmanCoulter，目录号系OCI_AML3(DSMZ，目录号ACC582)的肽脉冲细胞共培养后，评估了工程改造的T细胞的培养基(Xvivo基础培养基：无细胞因子+1uL/mL的GolgiPlug+0.7uL/mL的GolgiStop(具有30uL/mL的CD107aAPC/Cy7)(3ul/孔))中脉冲4_5小时，其中滴定量的9_mer肽VLDFAPPGA(VLD)或RMFPNAPYL(RMF)肽浓度范围为0nM至5000nM。将基因编辑的TCR+T细胞以1×10^6TCR插入细胞/ml悬浮在含有最终浓度为30ul/mlCD107aAPC/Cyanine7抗体(Biolegend)、[1051]EF1a(或EF_1α)和内源启动子对T细胞杀伤和细胞因子释放的影响通过在每个样中示出了表达TCR_A的细胞的剂量应答曲线(AV21和AV11)。在表28和图18B中示出了表达[1052]表28.在有和没有外源启动子的情况下，在辑的T细胞与抗CD3e和适当的V_β试剂(PE)共同染色，以通过流式细胞术鉴定工程改造的绘制了表29中数据的工程改造的TCR_A和TCR_BCD3+Vb7.2+细胞的表面表达的代表性示[1059]使用内源或外源启动子的AV20_TCR_D和AV18_TCR_DCD3+Vb7.2+细胞的百分比在表30中示出。测量了CD8+和CD4+细胞群体中工程改造的TCR_D的表面表达，如表30和图白酶3/7红色试剂(EssenBioscience)。使用Incucyte活细胞分析系统(EssenBioscience)和IncucyteS3分析软件(版本2018B)来定量6小时后来自半胱氨酸蛋白酶3/7DuosetELISA试剂盒(R&DSystems)通过ELISA定量IL2和IFN_γ细胞因[1088]还分别通过测量CD107a和细胞内细胞因子染色评估了工程改造的T细胞的细胞毒测量工程改造的T细胞中的CD107a来评估在有TRBC敲除的情况下由表达的TCR产生的细胞细胞对抗原呈递细胞的非特异性反应性。根据制造商的说明，用CellTraceViolet(Invitrogen)标记工程改造的T细胞。使用MACS(Miltenyi)去除同种异体PBMC中的CD3+细胞，并用于刺激CTV标记的T细胞。具体而言，将5x104个T细胞与3x104CD3贫化的同种异体表36和图33A_B中示出了用低水平CellTraceViolet(CTV)染色的细胞(即具有高增殖的细胞)的平均百分比。图33A和33B示出了用于测定CTV水平的门控。对于测试的每种插入的同源臂如上所述。许多还包括一个或多个启动子序列、切